Кишечные эпителиальные клетки (КЭК) и дендритные клетки (ДК) играют ключевую роль в отборе антигенов и поддержании гомеостаза кишечника. Однако взаимодействие комменсальных бактерий с поверхностью кишечника остается не в полной мере ясным. Здесь мы исследовали реакции иммунных клеток на комменсальные и патогенные
бактерии. Человеческие КЭК HT-29 инкубировали с Bifidobacterium infantis 35624, Lactobacillus salivarius UCC118 или Salmonella typhimurium UK1 в течение различных периодов времени или предварительно обрабатывали пробиотиком в течение 2 часов до стимуляции S. typhimurium или флагеллином. Для анализа экспрессии воспалительных генов использовали генные матрицы. Активацию ядерного фактора (ЯФ) «каппа-би», секрецию интерлейкина (ИЛ)-8, присоединение возбудителей к КЭК и экспрессию гена муцин-3 (MUC3) и гена E-кадгерин количественно определяли с
помощью анализа TransAM, методом иммуноферментного анализа (ИФА), флуоресценции и полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) соответственно. С помощью ИФА определяли секрецию ИЛ-10 и фактора некроза опухоли (ФНО) в ДК периферической крови, обработанных бактериями. S. typhimurium увеличивала экспрессию 36 из 847 иммунных генов, включая ядерный фактор «каппа-би» и ИЛ-8. Комменсальные бактерии не изменяли уровни экспрессии любого из 847 генов. Однако B. infantis и L. salivarius ослабляли как секрецию ИЛ-8 в начале, так и индуцированные S. typhimurium провоспалительные реакции. B. infantis также ограничивала индуцированную флагеллином секрецию белка ИЛ-8. Комменсальные бактерии не увеличивали экспрессию MUC3 или E-кадгерина или не
препятствовали связыванию патогена с клетками HT-29, но стимулировали секрецию ИЛ-10 и ФНО-α в ДК. Данные показывают, что, хотя кишечный эпителий иммунологически находится в состоянии покоя, при взаимодействии с B. infantis или L. salivarius эти комменсальные бактерии оказывают иммуномодулирующее действие на кишечные иммунные клетки, которые опосредуют реакции хозяина на флагеллин и кишечные патогены.

Ключевые слова: комменсальные бактерии; флагеллин; интерлейкин-8; кишечный эпителий; муцины

По разным направлениям оспаривается тот факт, что желудочно-кишечный тракт человека должен быть толерантным к пищевым антигенам и эндогенной микрофлоре и одновременно распознавать и сигнализировать о наличии патогенов. Эпителий играет решающую роль в поддержании кишечного гомеостаза1 и активно продуцирует постоянные кишечные бактерии, патогены и другие антигены2, 3. Эпителий покрыт слизью, которая защищает поверхность слизистой оболочки путем ограничения доступа патогенов4.
Слизь в основном состоит из сложных гликопротеинов, называемых муцинами, которые кодируются различными
муциновыми (MUC) генами4, 5. Кишечные эпителиальные клетки (КЭК) выделяют много медиаторов, участвующих в
иммунных ответах на потенциально патогенные организмы, включая антибактериальные пептиды, такие как дефензины6,
муцины, включая MUC34, и хемокины и цитокины, такие как интерлейкин (ИЛ)-87. ИЛ-8, хемокин C-X-C, транскрипционно регулируемый ядерным фактором (ЯФ) «каппа-би»8, демонстрирует мощную хемотаксическую активность нейтрофилов9. ИЛ-8 секретируется КЭК в ответ на воздействие различных патогенных бактерий10 и провоспалительных цитокинов,
таких как фактор некроза опухоли (ФНО)-α. Кроме того, сообщалось, что некоторые непатогенные комменсальные
бактерии, такие как Escherichia coli Nissle 191711, 12, но не Lactobacillus reuteri, Lactoba-cillus rhamnosus GG или
пробиотический коктейль VSL# 311–13, индуцируют секрецию ИЛ-8 в КЭК.
Антиген-представляющие дендритные клетки (ДК) находятся на поверхности слизистой оболочки и отбирают
комменсальные и патогенные бактерии14, 15. Кроме того, ДК кишечника могут непосредственно вбирать в себя содержимое просвета кишечника, расширяя дендриты между КЭК16.
Рецепторы распознавания структуры хозяина, включая толл- подобные рецепторы (ТПР), играют фундаментальную роль в активации иммунных клеток в ответ на специфические микробные молекулярные паттерны, которые связаны с
различными организмами, включая бактерии, грибы и вирусы17. КЭК и ДК постоянно выделяют несколько ТПР, в
том числе ТПР5, который реагирует на мономерные субъединицы флагеллина бактериальных жгутиков18–20. В
эпителии ТПР5 является ключевым медиатором провоспалительных реакций в ответ на воздействие флагеллина патогенных и комменсальных бактерий21–23.
Флагеллин также стимулирует созревание реагирующих ДК18. Вместе с ДК и КЭК ТПР, таким образом, представляют собой
составной компонент врожденной иммунной системы слизистой оболочки. Пробиотики, комменсальные микроорганизмы, которые могут быть использованы с пользой для здоровья, продемонстрировали терапевтический эффект при колите,
изучаемом на мышиных моделях24, 25, и у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК)26–28,
диареей29, 30 и в последнее время синдромом раздраженного кишечника31. Несмотря на усиление признания важности
полостной флоры в развитии колита32, 33 и почти парадоксальных преимуществ, получаемых в результате
применения при этом некоторых пробиотиков, терапевтические подходы, которые модулируют
бактериальную нагрузку, осложняются ограниченным пониманием взаимодействия флоры хозяина на поверхности
эпителия. В этом исследовании мы изучили ответы иммунной клетки на воздействие Salmonella typhimurium, флагеллина и
Bifidobacterium infantis и Lactobacillus salivarius, двух комменсальных штаммов, продемонстрировавших наличие
пробиотических свойств24, 31, 34. Мы показали, что, хотя эпителий иммунологически не реагирует на B. infantis и L. salivarius, эти комменсальные бактерии индуцируют секрецию регуляторных цитокинов в ДК. Кроме того, данные
показывают, что B. infantis и L. salivarius функционально модулируют эпителий, ослабляя провоспалительные реакции,
вызванные S. typhimurium и флагеллином.

Бактерии и условия роста

Salmonella typhimurium UK1 (любезно предоставленная Р. Кертисом III, Вашингтонский университет в Сент-Луисе, МО), Bifidobacterium infantis 35624 и Lactobacillus salivarius подвида Salivarius UCC1185 хранились в 50 % глицерине при -70°. До использования в ходе исследований S. typhimurium культивировали при 37° в триптическом соевом бульоне (ТСБ) (Мерк, Дармштадт, Германия) в течение 18 ч в аэробных условиях, B. infantis культивировали анаэробно при 37° в агаре МРС (Мерк), дополненном 0·05 % цистеином (Сигма-Алдрич, Сент- Луис, MO), в течение 48 часов, L. salivarius культивировали
анаэробно при 37° в бульоне МРС в течение 18 часов.
Бактерии стационарной фазы центрифугировали, повторно растворяли в стерильном фосфатном буферном растворе (ФБР) и окрашивали по Граму для подтверждения чистоты. Бактериальное число оценивали, измеряя оптическую плотность при 600 нм, и связывали значение оптической плотности со стандартной кривой колониеобразующих единиц (КОЕ) на МРС-агаре или триптическом соевом агаре (ТСА) (Мерк).

Культура эпителиальных клеток

В этом исследовании была выбрана линия эпителиальных клеток толстой кишки человека HT-29 (Американская
коллекция клеточных культур, Манассас, Виргиния), так как эта модель КЭК широко использовалась многими группами, исследующими ответ эпителиальных клеток на воздействие бактерий11, 13, 36,3 7. Клетки HT-29 культивировали в модифицированной среде МаКоя 5А (Гибко-БРЛ, Гранд Айленд, Нью-Йорк), дополненной 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), инактивированной теплом (Сигма-Алдрич), с/без 100 единиц/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина (Гибко-БРЛ). Клеточная линия HeLa (эпителиеподобные клетки шейки матки человека) (АТСС) культивировалась в минимальной питательной среде (Гибко-БРЛ), дополненной 0·1 мМ незаменимых аминокислот (Гибко-БРЛ), 1·5 мМ л- глутамина, 10 % ЭТС, инактивированная нагреванием, 100 единиц/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки обычно размножались в 75 см тканевых культуральных колбах при 37° в увлажненном 5 % СО2-
инкубаторе до тех пор, пока заселенность не приблизилась к 80–90 %. Затем клетки трипсинизировали и использовали
в экспериментальных исследованиях, как указано ниже.

Обработки клеток HT-29

В ходе всех анализов жизнеспособность клеток определяли путем вытеснения трипанового синего, и известное
количество клеток НТ-29 высевали в культуральные 25- сантиметровые колбы, 9·6-сантиметровые 6-луночные
планшеты или 3·8-сантиметровые 12-луночные планшеты. В некоторых экспериментах через 24 часа клетки HT-29
инкубировали в течение различных периодов времени с B. infantis, L. salivarius или S. typhimurium при соотношении
бактерий к эпителию 10:1, дозе, используемой ранее другими В других исследованиях клетки НТ-29 выращивали до
слияния, а слившиеся монослои обрабатывали 1х105, 1х106 или 1х107 КОЕ/мл В. infantis или L. salivarius. Были
проведены исследования дозозависимых реакций для определения оптимальных концентраций флагеллина и
ФНО-α для стимуляции КЭК, а затем клетки НТ-29 обрабатывали 0·5 мкг/мл очищенного флагеллина S. typhimurium (ИнвивоГен Корп., Сан-Диего, Калифорния) или 5 нг/мл ФНО-α (Р энд Д Системс, Миннеаполис, Миннесота). Выживаемость бактерий после 1, 2, 6 или 11 часов инкубации с клетками НТ-29 оценивали путем нанесения серийных разведений супернатантов клеточной культуры на МРС-агар или ТСА. После 24-часовой инкубации (для S. typhimurium и L. salivarius) или 48- часовой инкубации (для B. infantis) КОЕ количественно определяли. В некоторых экспериментах клетки HT-29
предварительно обрабатывали в течение 2 часов известной дозой комменсальных бактерий и впоследствии заражали эквивалентной дозой S. typhimurium или обрабатывали 0·5 мкг/мл флагеллина или 5 нг/мл ФНО-а в течение различных периодов времени.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность КЭК оценивалась с использованием иодида пропидия. Если коротко, супернатанты клеточной
культуры удаляли из необработанных и обработанных бактериями клеток HT-29. Клетки очищали, промывали в ФБР и повторно растворяли в 50 мкг/мл йодида пропидия (Сигма-Алдрич) и 5 единицах Кунитца/мл рибонуклеазы A в ФБР (Сигма-Алдрич). Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитометра Epics Elite (Бекмен
Культер, Инк., Фуллертон, Калифорния), а флуоресценция йодида пропидия обнаруживалась при 675 нм. pН соответствующих супернатантов клеточной культуры измеряли с использованием лабораторного рН-метра PHM61 (Радиометр A/С, Копенгаген, Дания).

Генетические чипы

Чипы экспрессии цитокинов человека (Р энд Д Системс) использовались для изучения экспрессии воспалительных
генов в клетках HT-29, обработанных бактериями. Каждая мембрана чипа содержала 847 клонированных кДНК,
представляющих гены, связанные с иммунной системой, включая различные цитокины, хемокины и другиеиммунорегуляторные факторы, отпечатанные как продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) на положительно
заряженной нейлоновой мембране. Если коротко, клетки ХТ-29 высевали в 6-луночные планшеты в среде «Игла в
модификации Дульбекко» (СИМД) (Гибко-БРЛ) с добавлением 10 % ЭТС, инактивированной нагреванием, и
50 мкг/мл гентамицина (Гибко-БРЛ) и выращивали до слияния. Монослои НТ-29 обрабатывали приблизительно
1х107–108 клеток/лунку стационарной фазы B. infantis, L. salivarius или S. typhimurium в течение 0·5, 2 или 6 часов.
Необработанные клеточные монослои служили контролями. После обработки клетки очищали и центрифугировали при 400 g в течение 10 мин. Полиаморфную мРНК экстрагировали из клеточных гранул
с использованием набора Dynalbeads® mRNA Direct (Динал, Осло, Норвегия) в соответствии с рекомендациями
производителя и обрабатывали без РНКазы ДНКазой (Эмбион, Кэмбриджшир, Соединенное Королевство).
Целостность мРНК оценивали с помощью электрофореза с 2 % агарозным гелем и окрашивания этидия бромидом.
Затем человеческие цитокиноспецифические праймеры (Р энд Д Системс) прожигали до 600 нг мРНК в 11 мкл воды, содержащей диэтиловый пирокарбонат (ДЭПК). мРНК была обратно транскрибирована с использованием набора для мечения и гибридизации кДНК (Р энд Д Системс) в соответствии с инструкциями производителя. Реакция содержала 20 мкКи [α-33P] dCTP (Амершам Фармация, Бакингемшир, Великобритания), смесь dNTP (333 мкМ dATP, dTTP и dGTP и 1·67 мкМdCTP) (Р энд Д Системс), 30 единиц ингибитора РНКазы (Эмбион) и 50 единиц обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (ОТ). Не вошедшую [α-33P] dCTP удаляли из кДНК с использованием центрифужной колонки Sepha-dex® G-25 (Сигма-Алдрич).
Гибридизацию [α-33P]dCTP-меченого кДНК-образца с использованием чипов экспрессии человеческого цитокина
проводили в соответствии с протоколом производителя. После гибридизации мембраны чипов подвергали
воздействию высокоинтенсивных люминофорных экранов при комнатной температуре в течение ночи. Экраны были
проверены с использованием Molecular Dynamics Storm Phosphorimager (Амершам Биосайнсис, Пискатауэй, Нью-
Джерси), а чипы были проанализированы с использованием PHORETIX Array 2 (Нонлинеар Динамикс, Ньюкасл-апон-
Тайн, Великобритания) и программного обеспечения FOCUS© (Стив Коул, Лос-Анджелес, Калифорния). Каждый
чип был выполнен в двух экземплярах в каждом из двух независимых экспериментов.

Анализ экспрессии мРНК ИЛ-8 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

2-часовые образцы мРНК из экспериментов с использованием генетических чипов были отобраны для ОТ-ПЦР-анализа мРНК ИЛ-8. мРНК (250 нг) подвергали обратной транскрипции с получением кДНК с использованием ингибитора РНКазы 40 единиц/мкл (Эмбион) и системы обратной транскриптазы Expand (Роше Дайэгностикс Лтд, Ист-Сассекс, Соединенное Королевство) в соответствии с протоколом производителя. ОТ-ПЦР в реальном времени для человеческого ИЛ-8 проводили с помощью LightCycler 1·5 (Роше) с использованием ранее описанного набора праймеров38 ИЛ-8 (МВГ-Биотех,
Эберсберг, Германия) и набора Fast Start DNA Master SyBr Green I, указанного изготовителем (Роше). Расчеты проводили с использованием GAPDH в качестве относительного стандарта, а праймеры GAPDH (прямой, 5'-
ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', обратный, 5'-TCCAC CACCCTGTTGCTGTA-3') были синтезированы с помощью Clontech (БД Биосайнсис, Сан-Хосе, Калифорния).

Анализ экспрессии мРНК MUC3A, MUC3B и Е-кадгерина

У человека MUC3 входит в число преобладающих тонкотолстокишечных муцинов4, а E-кадгерин представляет собой белокклеточной поверхности, вовлеченный в клеточную адгезию39.
Мы использовали ОТ-ПЦР в реальном времени для изучения экспрессии E-кадгерина и двух генов MUC3, MUC3A и
MUC3B40 в обработанных комменсалами клетках HT-29. В отсутствие антибиотиков слившиеся монослои НТ-29 обрабатывали 1х107 клеток/мл B. infantis или L. salivarius в течение 1 или 2 часов. Клетки собирали путем трипсинизации,
а общую РНК выделяли с использованием набора Absolutely RNA® Miniprep (Стратаген, Ла-Холья, Калифорния) в
соответствии с протоколом производителя. Образцы дважды обрабатывали без РНКазы ДНКазой I. Общая РНК (1 мкг)
была обратно транскрибирована с помощью случайных праймеров (Роше) с использованием ингибиторов РНКазы
ImProm-II RT (Промега, Мэдисон, Висконсин) и RNasin Plus (Промега). Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на
5 мкл полученной кДНК с использованием LightCycler TaqMan Master (Роше) и гликозилазы LightCycler Uracil-DNA (Роше),
как указано изготовителем, вместе с зондами Universal Probe- Library (Эксикон, Ведбек, Дания) в конечном реакционном
объеме 20 мкл. Праймеры, разработанные с использованием центра проектирования универсальных зондов ProbeLibrary
(http://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl...), были синтезированы компанией МВГ Биотех Лтд. ПЦР-
амплификацию проводили с использованием прибора LightCycler 1·5 (Роше). Условия термического циклирования
составляли 2 мин при 40° и 10 мин при 95°, а затем 45 циклов амплификации при 95° в течение 10 секунд, 60° в течение
30 секунд и 72° в течение 1 секунды, а цикл охлаждения 40° в течение 30 секунд. Расчеты проводили с использованием
GAPDH в качестве эндогенного контрольного гена-регулятора.
Разница в экспрессии гена была рассчитана в соответствии со стандартной формулой 2(Ec – Rn) – (Et – Rt), где Ec – порог
пересечения (пп) экспериментального гена в необработанных контрольных образцах, Rn – пп GAPDH в необработанных
образцах, Et – пп экспериментального гена в обработанных образцах, а Rt – пп GAPDH в обработанных образцах. Данные
представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (СО) трех независимых экспериментов.

Иммуногистохимическое окрашивание для внутриклеточного ядерного фактора «каппа-би»

Клетки HeLa были выбраны в качестве модели эпителиальных клеток для визуализации внутриклеточной
локализации ядерного фактора «каппа-би», так как они имеют оптимальное соотношение ядро-цитоплазма и
являются эпителиальными клетками13. Активация внутриклеточного ядерного фактора «каппа-би» в модели
оценивали с использованием иммуногистохимии, как описано ранее13. Если коротко, клетки HeLa (1х107 клеток/мл) выращивали на покровных стеклах в 6- луночных планшетах в течение 3 дней и инкубировали с 1х107 B. infantis или 20 нг/мл ФНО-α в течение 30 мин. Покровные стекла промывали, фиксировали, блокировали и инкубировали с 6 мкг мышиного антитела к ядерному фактору «каппа-би» (БД Фрминген, Миссиссога, Онтарио, Канада) с последующим конъюгированием с флуоресцеина изотиоцианата с козьим антимышиным иммуноглобулином G (IgG) (1:64) (Сигма-Алдрич), как описывалось ранее13.
Покровные стекла были помещены в глицерол-ФБР, а слайды просматривали с использованием конфокального
микроскопа LSM510 (Карл Цайсс, Йена, Германия).

Количественное определение фактора транскрипции ядерного фактора «каппа-би» p65

Клетки НТ-29 (3х106) высевали в колбы для культур тканей емкостью 25 см2 в 5 мл среды без антибиотиков. Через
24 часа инкубации среду заменяли средой, не содержащей антибиотиков, и без сыворотки, клетки обрабатывали
S. typhimurium, флагеллином или ФНО-α с/без предварительной пробиотической обработки в течение различных периодов времени. Ядерные белки экстрагировали с использованием набора Active Motif Nuclear Extract (Эктив Мотиф Юорэп, Риксенстарт, Бельгия) в соответствии с инструкциями производителя, общую концентрацию белка в лизатах определяли по
анализу Брэдфорда (Био-Рад, Геркулес, Калифорния).
Активацию субъединицы ядерного фактора «каппа-би» p65 в 5 мкг ядерных экстрактов HT-29 определяли с
использованием ядерного фактора «каппа-би» p65 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием
набора для анализа фактора транскрипции (анализ ТрансАМ) (Эктив Мотиф Юорэп) в соответствии с протоколом производителя. Ядерный фактор «каппа-би», обнаруживающий антитело, распознает эпитоп на p65,
который доступен только при активации ядерного фактора «каппа-би». Для оценки специфичности анализа использовался положительный контрольный ядерный экстракт клеток Юрката, имеющихся в наборе.

ИФА ИЛ-8

Подконфлюентные или слившиеся клетки НТ-29, выращенные в средах, дополненных антибиотиками и сывороткой, обрабатывали известными дозами пробиотических бактерий или провоспалительных стимулов в течение 6 или 24 часов. После обработки уровни иммунореактивного белка ИЛ-8 в супернатантах клеточной культуры определяли количественно с использованием набора ELISA DuoSet (Р энд Д Системс) в соответствии с протоколом производителя. В анализах на основе
генетических чипов набор IL-8 DuoSet использовался также для оценки внеклеточного уровня белка ИЛ-8 в супернатантах клеточной культуры и внутриклеточного ИЛ-8 в этих клетках после лизиса с использованием ледяной водой.

Анализы, определяющие бактериальное взаимное влияние

Пробиотическое взаимное влияние на связывание патогенов с клетками НТ-29 оценивали с использованием двух независимых методов, чашечного метода разведения и биофлуоресценции. Для чашечного метода разведения
клетки HT-29 (1х106), высеянные в 6-луночные планшеты в среде, свободной от антибиотиков, инкубировали в течение
24 часов. Затем среду пополняли, клетки предварительно обрабатывали с или без 10:1 B. infantis или L. salivarius в
течение 2 часов до заражения с 10:1 S. typhimurium в течение еще 2 часов. После заражения среду удаляли, клетки промывали пять раз 2 мл теплой среды для удаления неадгезивных бактерий. Клетки со связанными бактериями
лизировали, используя стерильную дистиллированную воду, дополненную 0·1 % бычьим сывороточным альбумином в течение 30 мин при 4° при перемешивании, как описано ранее41. КЭК, ассоциированные с S. typhimurium, определяли как адгезивные и внутриклеточные бактерии и количественно определяли количество КОЕ разбавленных клеточных лизатов в ТСА.
Независимо S. typhimurium, выращенную в течение ночи в ТСБ, осаждали центрифугированием и промывали стерильным
раствором 0·8 5% NaCl. S. typhimurium (2х108) метили, используя 1·5 мкл SYTO 9® (Молекуляр Пробс, Инк., Юджин, Орегон), зеленое флуоресцентное окрашивание нуклеиновой кислоты, как указано изготовителем. Клетки HT-29 заражали
S. typhimurium, меченой SYTO 9 в соотношении 10:1, в течение 2 часов с/без предварительной пробиотической обработки.
Затем клетки пять раз промывали теплым раствором 0·85 % NaCl, клетки с ассоциированными бактериями лизировали, как
описано выше. Аликвоты лизата (200 мкл) переносили в лунки 96-луночного планшета с плоским дном, а флуоресценцию
определяли путем визуализации in vivo с использованием системы визуализации IVIS™ 100 и Living Image Software
(Ксеноген, Аламеда, Калифорния). Количество бактерий, связанных с КЭК, определяли по стандартной кривой серийных разведений SYTO 9-меченой S. typhimurium по отношению к интенсивности флуоресценции. Для обоих методов пробиотическую интерференцию оценивали путем сравнения связывания S. typhimurium с клетками HT-29 с/без
пробиотической предварительной обработки.

Бактериальная обработка ДК, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК)

В соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по этике Университетской клинической больницаы, Корк,
Ирландия, периферическая кровь от здоровых добровольцев (n = 3) была собрана путем венепункции в стерильные пробирки для вакуумирования этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). МКПК очищали от буферизованных покрытий в гистоскопических пробирках (Грейнер Био-ван, Инк., Лонгвуд, Флорида) с использованием центрифугирования градиента Ficoll- Hypaque (Фармация, Дюбендорф, Швейцария) (400 g в течение 30 мин). МКПК отбирали с внутренней поверхности и четыре раза промывали чистым ФБР с Ca2+ и Mg2+ и под конец повторно растворяли в дегазированной буферной колонке с Ca2+ и Mg2+ (ФБР, pH 7·2, дополненный 0·5 % бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мМ ЭДТА). Впоследствии моноциты были выделены из мононуклеарных клеток путем негативного отбора с использованием набора Monocyte Isolation Kit II (Мильтений Биотэк) и с колонкой и сепаратором MACS (Мильтений Биотэк) в соответствии с инструкциями
производителя. Для получения ДК моноциты инкубировали в течение 5 дней в СИМД, содержащей 10 % ЭТС, 100 000 МЕ/мл гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора и 40 000 МЕ/мл ИЛ-4 (БД Биосайнсис). Чистоту клеток оценивали с помощью окрашивания поверхности клеток и проточной цитометрии с использованием антител, полученных от компании БД Биосайнсис, а их жизнеспособность определяли путем вытеснения трипанового синего. Чистота клеток,
определяемая с помощью HLA-позитивного антигена класса II и CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56-негативных клеток, составляла > 85 %, а жизнеспособность клеток составляла > 98 %. Затем ДК, полученные из МКПК (1х106 клеток/мл), высевали в 24-луночные планшеты емкостью 1·9 см2 в СМИД, дополненную 10 % ЭТС, инактивированным нагреванием, 100 мкг/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина и 2·5 мкг/мл фунгизона (Гибко-БРЛ).
Клетки обрабатывали только средой (отрицательные необработанные контрольные образцы) или B. infantis и L. sali-varius в соотношении 10:1 в течение 48 часов. Затем уровни белков ИЛ-10 и ФНО-α в супернатантах клеточной культуры определяли количественно с использованием коммерчески доступных наборов для ИФА (Р энд Д
Системс) в соответствии с протоколами производителя. Чтобы определить уровни эндотоксина в комменсальных
бактериальных препаратах, мы использовали анализ гельтромб лизата амебоцитов мечехвоста (ЛАМ) с чувствительностью 0·03 единицы эндотоксина/мл (Чарльз Ривер Лабораторис, Инк., Чарлстон, Южная Каролина).
Анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя, для подтверждения чувствительности ЛАМ- реагента использовали стандартный контрольный эндотоксин Escherichia coli (Чарльз Ривер Лабораторис, Инк.). Водопроводная вода использовалась в качестве положительного контроля, а ЛАМ-реагентная вода (Чарльз Ривер Лабораторис, Инк.) – в качестве отрицательного контроля.

Статистика

Все данные выражаются как среднее значение ± СО (стандартная ошибка). Статистический анализ проводился с использованием непарных двухсторонних t-тестов Стьюдента или анализа вариаций (ANOVA). Значения P < 0·05 считались статистически значимыми, а n – количество проведенных независимых экспериментов

Жизнеспособность КЭК после бактериальной обработки

Чтобы определить, оказывали ли бактерии, применяемые в ходе исследования, непосредственное влияние на модель
клеточной линии, клетки НТ-29 подвергались воздействию B. infantis, L. salivarius или S. typhimurium в присутствии
антибиотиков в течение разных периодов времени. По сравнению с необработанными контролями ни два пробиотических штамма, ни S. typhimurium не оказывали токсического действия на клетки НТ-29 в течение 24- часового периода (рис. 1а). При парентеральном введении по сравнению с необработанными клетками наблюдалось незначительное улучшение выживаемости через 24 часа после того, как клетки НТ-29 подвергались воздействию бактерий, хотя биологическая значимость этого факта неясна. Более того, совместная инкубация клеток НТ-29 с каждым бактериальным штаммом в отдельности не оказывала отрицательного влияния на рН среды роста (рис. 1b); не наблюдалось чрезмерного бактериального роста, и через 6 ч < 0·02 % бактерий оставалось жизнеспособными (рис. 1с). Поэтому в условиях анализа целостность КЭК не подвергалась риску во время совместной инкубации с B. infantis, L. salivarius или S. typhimurium.

Экспрессия воспалительных генов после инкубации с бактериями

Чипы экспрессии цитокинов человека использовались для изучения экспрессии воспалительных генов в клетках HT-
29, обработанных бактериями.
Напротив, воздействие B. infantis в то же время не вызывало ядерной транслокации, а ядерный фактор «каппа-би»
локализовался по-прежнему в цитоплазме (рис. 2а). Аналогично в клетках HT-29 воздействие B. infantis или L. salivarius в течение 30 минут или 1 часа не стимулировало ДНК-связывающую активность ядерного фактора «каппа-би» p65 по сравнению с необработанными клетками, тогда как заражение S. typhimurium или обработка ФНО-α значительно увеличивало ДНК- связывающую активность ядерного фактора «каппа-би» через 1 час или 30 мин соответственно (рис. 2b). ДНК- связывающая активность ядерного фактора «каппа-би» была обнаружена в положительном контрольном ядерном
экстракте клеток Юрката, а специфичность связывания ядерного фактора «каппа-би» в ходе анализа была подтверждена конкуренцией со свободным постоянным олигонуклеотидом дикого типа ядерного фактора «каппа-би» или мутировавшего олигонуклеотида ядерного фактора «каппа-би» (рис. 2b). Данные демонстрируют, что эпителиальные клетки по-разному реагируют на различные антигены, и, в отличие от S. typhimurium и ФНО-α, комменсальные бактерии, используемые в этом
исследовании, не индуцируют ядерную транслокацию или ДНК-связывающую активность ядерного фактора «каппа- би».

S. typhimurium, а не B. infantis или L. salivarius индуцируют экспрессию ИЛ-8

В субконфлюентных клетках HT-29, обработанных B. infantis или L. salivarius, уровни мРНК ИЛ-8 или белка, обнаруженные через 2 или 24 часа соответственно, были сходны с уровнями, обнаруженными на исходном уровне в необработанных клетках (рис. 3a и 3b). Напротив, заражение S. typhimurium стимулировало значительное увеличение экспрессии мРНК ИЛ-8 через 2 часа (13·3- кратное) и секрецию белка ИЛ-8 через 24 часа (в 7 раз) по сравнению с необработанными клетками. Как показано на рис. 3 (с), S. typhimurium быстро индуцировала мРНК ИЛ-8, и максимальные уровни были обнаружены в течение 2 часов после заражения. Заражение также приводило к зависимому от времени накоплению внеклеточного ИЛ-8, что было связано с соответствующим уменьшением количества определяемого внутриклеточного белка ИЛ-8 (рис. 3c).

B. infantis и L. salivarius ингибируют секрецию ИЛ-8 на начальном уровне

Затем мы рассмотрели вопрос о том, влияет ли воздействие с увеличением доз B. infantis или L. salivarius (1х105, 1х106
или 1х107 КОЕ/мл) на секрецию ИЛ-8 сливающимися монослоями НТ-29. Уровни белка ИЛ-8 измеряли через
6 часов. Наблюдалось зависимое от дозы ингибирование ИЛ-8 слившимися монослоями НТ-29 по сравнению с
исходным уровнем (рис. 4). При концентрации 1х10 КОЕ/мл, которая в экспериментальных условиях эквивалентна приблизительно 10 бактериям на эпителиальную клетку, как B. infantis, так и L. salivarius значительно ингибировали базальную секрецию ИЛ-8 на 38 и 44 % соответственно. Это говорит о том, что эти комменсальные бактерии оказывают
противовоспалительное действие на эпителий, снижая уровень секреции ИЛ-8.

Пробиотические бактерии ослабляют индуцированные S. typhimurium провоспалительные реакции

Экспрессия мРНК ИЛ-8 находится под регуляторным контролем ядерного фактора «каппа-би»8, и наши данные показывают, что B. infantis или L. salivarius не активируют ядерный фактор «каппа-би» и не вызывают продуцирование
ИЛ-8 клетками HT-29. Учитывая эти данные и заключение о том, что пробиотические бактерии влияют на секрецию
ИЛ-8 на исходном уровне, мы выяснили, может ли B. infantis или L. salivarius ингибировать активацию ядерного фактора «каппа-би» или секрецию ИЛ-8 в ответ на воздействие S. typhimurium. Субконфлюэнтные клетки НТ- 29 предварительно обрабатывали B. infantis или L. salivarius в соотношении 10:1 в течение 2 часов до стимуляции S. typhimurium или ФНО-α. Уровни активированного ядерного фактора «каппа-би» в ядерных экстрактах определяли через 0·5, 1 и 2 часа, а уровень белка ИЛ-8 измеряли через 24 часа.

Предварительное воздействие либо B. infantis, либо L. salivarius значительно уменьшало активность связывания
ядерного фактора «каппа-би», индуцируемую S. typhimurium через 1 или 2 часа после заражения (рис. 5а).
В течение 30 мин ФНО-α стимулировал увеличение в 8·9 раз активации ядерного фактора «каппа-би» по сравнению с
необработанными клетками, и, хотя предварительное воздействие L. salivarius или B. infantis не влияло на активацию ядерного фактора «каппа-би» ФНО-α через 30 мин, значительное снижение (уменьшение на 16 %) наблюдалось в клетках, обработанных B. infantis через 1 ч после ФНО-α-стимуляции (данные не показаны).
Как показано на рис. 5b, S. typhimurium индуцировала 1897 (±292) пг/мл ИЛ-8, и предварительное воздействие B. infantis или L. salivarius значительно ослабляло секрецию ИЛ-8, индуцированную S. typhimurium, на 23·5 или 31 % соответственно. Хотя ФНО-α проявлял сильную индукцию 50 550 (±9933) пг/мл ИЛ-8, пробиотическая предварительная обработка не оказывала существенного влияния на ФНО-oc-индуцированную секрецию ИЛ-8 (данные не показаны). В совокупности эти данные
показывают, что B. infantis и L. salivarius значительно ослабляют провоспалительные реакции, индуцируемые S. typhimurium.

Связь S. typhimurium с клетками HT-29 не блокируется пробиотическими бактериями

Затем мы определили, объяснялась ли модуляция индуцируемых S. typhimurium провоспалительных реакций
пробиотическими бактериями вмешательством в связывание патогенов с КЭК. Связывание S. typhimurium с клетками НТ-29 оценивали с/без предварительной пробиотической обработки с использованием биофлуоресценции и чашечного метода разведения. Эти два метода обеспечили дополнительными данными, и, как показано в таблице 2, предварительная обработка как B. infantis, так и L. salivarius не повлияла на количество КЭК, связанных с S. typhimurium, через 2 часа после заражения.
Эти данные показывают, что иммунорегуляторные эффекты пробиотических бактерий, наблюдаемые в этом исследовании, не связаны с конкурентным ингибированием связывания S. typhimurium с клетками HT-29.

B. infantis ингибирует индуцированную флагеллином секрецию ИЛ-8

Флагеллин является ключевым активатором провоспалительных реакций в КЭК в ответ на Salmonella22, 42. Поэтому мы исследовали, могут ли пробиотические бактерии ингибировать ответы КЭК на флагеллин Salmonella. Во-первых, в дозозависимых исследованиях мы инкубировали различные дозы флагеллина от S. typhimurium (0·1, 0·5 и 1·0 мкг/мл) со
слившимися монослоями НТ-29 и обнаружили, что при концентрации 0·5 мкг/мл флагеллин значительно
индуцировал активацию ядерного фактора «каппа-би» и секрецию ИЛ-8. Воздействие 0·5 мкг/мл флагеллина в
течение 1 часа приводило к 3·15-кратному (±0·3) увеличению активности связывания ядерного фактора «каппа-би» по сравнению с необработанными клетками, и 1876 (±262) мкг/мл ИЛ-8 обнаруживали через 6 часов (P < 0·05) (данные не показаны). Монослои НТ-29 обрабатывали в течение 2 ч либо B. infantis, либо L. salivarius (1х106 или 1х107 КОЕ/мл), а затем 0·5 мкг/мл флагеллина в течение 6 часов. Как показано на рис. 6, предварительная обработка L. salivarius не влияла на индуцированную флагеллином секрецию ТЛ-8 при любой испытуемой дозе. Однако индуцируемый флагеллином ИЛ-8 был значительно снижен в клетках, которые предварительно обрабатывали 1х107 КОЕ/мл B. infantis. Полученные результаты указывают на специфические антагонистические эффекты штамма на индуцируемую экспрессию ИЛ-8 в МЭК.

Экспрессия MUC3A, MUC3B и E-кадгерина после воздействия пробиотиков

Было высказано предположение, что некоторые штаммы пробиотических бактерий оказывают благотворное влияние на кишечный эпителий, регулируя экспрессию муциновых генов36, 43.
Мы использовали ОТ-ПЦР в реальном времени для определения экспрессии мРНК MUC3A и MUC3B в слившихся клетках HT-29, обрабатываемых в течение 1 или 2 часов 1х107 клеток/мл пробиотических бактерий. MUC3A и MUC3B мРНК определял в необработанных клетках НТ- 29, и, как показано на рис. 7, воздействие B. infantis или L. salivarius не оказывало существенного влияния на экспрессию этих генов. Аналогично не наблюдалось различий в экспрессии мРНК E-кадгерина после обработки комменсальными бактериями (данные не показаны).

Реакции цитокинов ДК после инкубации с пробиотиками

Мы исследовали влияние комменсальных бактерий, используемых в этом исследовании, на секрецию цитокинов миелоидными ДК. ДК обрабатывали B. infantis или L. salivarius в течение 48 часов, а уровни белка ИЛ-10 и ФНО-α определяли количественно.
Обе бактерии стимулировали значительное увеличение секреции ИЛ-10 и ФНО-α клетками ДК, выделенными из
МКПК, по сравнению с необработанными ДК (рис. 8). Эти эффекты не были результатом загрязнения эндотоксином
бактериальных суспензий, поскольку концентрация < 0·03 единицы эндотоксина/мл (предел количественного
обнаружения ЛАЛ) обнаруживалась в контрольных средах и бактериальных препаратах.

В настоящем исследовании мы показали, что КЭК реагируют по-разному на различные виды бактерий. В отличие от S. typhimurium, B. infantis или L. salivarius не вызывали провоспалительных реакций со стороны КЭК.
Однако B. infantis и L. salivarius функционально модулировали эпителий, ингибируя постоянную секрецию ИЛ-8 и ослабляя активацию ядерного фактора «каппа-би», индуцируемого S. typhimurium, и секрецию ИЛ-8. Кроме того, B. infantis ингибировала белок ИЛ-8, индуцируемый флагеллином, и оба комменсальных штамма стимулировали секрецию ИЛ-10 и ФНО-α миелоидными ДК. В совокупности эти данные демонстрируют, что B. infantis и L. salivarius оказывают иммуномодулирующие эффекты, которые опосредуют реакцию иммунных клеток кишечника на кишечные патогены и их антигенные компоненты.
Было показано, что комменсальные бактерии, их лиганды и факторы симбиоза, опосредованные комменсалами, необходимы для нормального развития иммунной системы слизистой оболочки и поддержания гомеостаза кишечника2, 44, 45, но их роль в физиологии кишечника не полностью ясна.
Здесь мы продемонстрировали, что эпителий кишечника обеспечивает устойчивый провоспалительный ответ на
воздействие S. typhimurium, но не B. infantis или L. salivarius. В частности, B. infantis и L. salivarius не стимулировали активацию ядерного фактор «каппа-би» или секрецию ИЛ-8. Аналогичным образом, другие комменсальные бактерии, включая L. rhamnosus GG, L. reuteri, Lactobacillus plantarum и коктейль VSL № 3, не активируют ядерный фактор «каппа-би» или ИЛ-811–13, 46. В ходе данного исследования эти наблюдения были значительно дополнены, и анализ генетических чипов показал, что в дополнение к ядерному фактору «каппа-би» и ИЛ-8 B. infantis или L. salivarius не увеличивают
экспрессию любого из других 845 изучаемых иммунных генов. Однако не все иммунные клетки не реагировали на
эти комменсальные бактерии, и они индуцировали секрецию регуляторных цитокинов миелоидными ДК. Это
подтверждает предыдущие исследования, в которых было показано, что пробиотические бактерии модулируют функцию ДК и способствуют индуцированию толерантности ДК47, 48. Кроме того, некоторые непатогенные бактерии могут активировать воспалительные процессы в кишечнике и индуцировать секрецию ИЛ-8 в КЭК11–13, 49. Показано, что непатогенный комменсальный штамм Bacteroides vulgatus активирует экспрессию ядерного фактора «каппа-би» и
провоспалительных генов в КЭК49. Однако эти эффекты были ингибированы присутствием иммунных клеток37, а
перекрестная иммунная реакция КЭК дифференциально влияет на провоспалительную экспрессию гена в ответ на
комменсальные бактерии50.
Наши данные показывают, что как B. infantis, так и L. salivarius ограничивали постоянную секрецию ИЛ-8. Этот эффект наблюдался только в сливных монослоях НТ- 29, демонстрируя важность неповрежденного барьера для
нормальной иммунной функции эпителиальных клеток. Более того, предварительная обработка B. infantis и L. salivarius ингибировала S. Typhimurium-, но не ФНО-α- индуцируемую секрецию ИЛ-8, хотя B. infantis замедляла активацию ядерного фактора «каппа-би», индуцируемого ФНО-α.
Это предполагает участие различных внутриклеточных сигнальных путей между опосредованными комменсалами
влияниями на индуцируемые S. typhimurium и ФНО-α провоспалительные реакции. Учитывая решающую роль ИЛ-8 в воспалительных процессах и импликацию кишечных бактерий в патогенезе ВЗК51, мы сделали вывод, что B. infantis
и L. Salivarius ослабляют секрецию ИЛ-8 в начале, и в ответ на S. typhimurium может иметь особую физиологическую
значимость в ВЗК и других воспалительных заболеваниях. Другие комменсальные штаммы, в том числе L. reuteri,
Bacteroides thetaiotaomicron, Salmonella pullorum и VSL № 3, проявили сходное влияние на секрецию ИЛ-8, индуцируемую
патогенами в КЭК11, 13, 52, 53, и L. reuteri, как было показано, ингибирует постоянный синтез, но не секрецию ИЛ-813.
Установлено, что флагеллин является предшественником для индуцируемых Salmonella ТПР5-провоспалительных
реакций в КЭК22, 42. В нашем исследовании B. infantis, но не L. salivarius ослабляли индуцируемую флагеллином секрецию
ИЛ-8, что указывает на то, что различные способы действия опосредуют специфические штамму антагонистические
эффекты на индуцируемую экспрессию ИЛ-8. Насколько нам известно, только один другой комменсальный штамм, B.
thetaiota-omicron, как сообщается, ограничивает опосредуемый флагеллином сигнал52. Хотя ответственный механизм
(механизмы) остается неизвестным, возможно, что поверхностные структуры, действуя через рецепторы клетокхозяев, модулируют воспалительные реакции54, 55, но наши данные не указывают на влияние ФНО в этом процессе. Было
высказано предположение, что рецепторные системы, антагонистические к действию ТПР, аналогичные SIGIRR (одиночной Ig ИЛ-1R-родственной молекуле) 56, участвуют в медиаторных защитных эффектах комменсальной флоры57.
Кроме того, комплекс структур клеточной поверхности, например липотейхоевая кислота Lactobacillus plantarum, оказывает дифференциальное воздействие на иммунную систему хозяина58. Способность кишечника переносить большое количество потенциально провоспалительных комменсальных бактерий может быть отчасти объяснена
противовоспалительным действием бактерий, таких как B. thetaiotaomicron и B. infantis, которые ограничивают передачу сигналов, индуцируемых флагеллином и Salmonella.
Продолжается изучение возможности B. infantis оказывать аналогичные эффекты на другие жгутиковые патогены.
Данные свидетельствуют о том, что ингибиторные эффекты B. infantis и L. salivarius опосредованы по крайней мере частично, через путь ядерного фактора «каппа-би». B. infantis и L. salivarius ингибировали индуцируемую S. typhimurium активацию ядерного фактора «каппа-би», а B. infantis не стимулировала ядерную транслокацию p65 в клетках HeLa. Были изучены несколько явных механизмов действия, с помощью которых комменсальные бактерии влияют на сигналы ядерного фактора «каппа-би» для ограничения воспаления. Они включают ингибирование убиквитинирования IkB-α или эпителиальной протеасомной функции53, 59 или ядерного экспорта транскрипционно активных p6552. Митоген-активированные протеинкиназы и механизмы протеинкиназы B также были вовлечены в защитные эффекты, опосредованные различными комменсальными бактериями11, 60. Кроме того, было описано несколько гомеостатических механизмов хозяина, которые ограничивают воспалительные реакции в кишечнике1, 57, 61.
Мы задались вопросом, были ли ингибиторные эффекты B. infantis и L. salivarius на индуцируемые S. typhimurium
провоспалительные реакции связаны с конкурентным исключением на поверхности эпителия. Такой защитный слой может содержать сами комменсальные бактерии или индукцию муциновых генов. Данные показывают, что эти комменсальные бактерии не препятствуют ассоциации S. typhimurium с клетками НТ-29. В соответствии с этим наблюдением, B. infantis и L. salivarius не индуцировали экспрессию MUC3A или MUC3B. Было показано, что VSL № 3 и другие штаммы Lactobacillus индуцируют экспрессию муцина11, 36, 43, 62, тем самым предотвращая адгезию патогенов к эпителиальной поверхности36, 43. Однако индуцируемая комменсальными бактериями регуляция муцина является специфичной для штаммов, и Lactobacillus acidophilus не стимулирует экспрессию MUC336. Следует отметить, что на экспрессию муцина влияет среда роста, а в других исследованиях клетки HT-29 постепенно перемещали в среду, не содержащую глюкозу, для преимущественного увеличения экспрессии мРНК MUC336, 43. Хотя было показано, что комменсальные бактерии модифицируют индуцируемые патогенами изменения в цитоскелетных и плотных соединениях белков, таких как замыкающий контакт, окклюдин и актинин11, 41, мы показали, что B. infantis или L. salivarius не индуцируют изменения в экспрессии мРНК E-кадгерина в клетках HT-29.
В заключение мы продемонстрировали, что КЭК остаются иммунологически спокойными при воздействии B. infantis или L. salivarius, но эти бактерии могут модулировать эпителиальные реакции для ограничения сигналов воспаления. Функциональные возможности, по- видимому, специфичны для штаммов, а точные механизмы, с помощью которых B. infantis и L. salivarius ограничивают воспалительные реакции, все еще изучаются. В совокупности эти данные демонстрируют, что B. infantis и L. salivarius оказывают иммуномодулирующее действие на КЭК, которые опосредуют реакции хозяина на флагеллин и кишечные патогены.

Работа авторов частично поддерживается Научным фондом Ирландии в форме гранта центра (Центр алиментарной
фармабиотики), Ирландским советом по исследованиям в области здравоохранения, Управлением высшего образования в Ирландии и Европейским союзом.

Следующий дополнительный материал доступен для этой статьи в Интернете:
Таблица S1. 847 клонированных кДНК, представляющих собой иммунные гены, при использовании чипов экспрессии человеческого цитокина применялись для
исследования экспрессии генов воспаления в клетках HT29, обработанных бактериями. Этот материал доступен как часть онлайн-статьи, размещенной по адресу из http://www.blackwell-synergy.com

Список литературы: смотрите в источнике