Лиам О'Махони1, Луис О'Каллаган1, Джейн МакКарти1, Дэвид Шиллинг2, Пол Скалли1, Шомик Сибарти1, Имон Каванаг2, Вильям О. Кирван2, Генри Пол Редмонд2, Джон Кевин Коллинс1 и Фергус Шанахан1

1Центр алиментарной фармабиотики и 2Кафедра хирургии, Ирландский национальный университет в Корке, Национальный университет Ирландии, Корк, Ирландия

Представлено 14 марта 2005 года; принято в окончательной версии 9 ноября 2005 года

Лиам О'Махони, Луис О'Каллаган, Джейн МакКарти, Дэвид Шиллинг, Пол Скалли, Шомик Сибарти, Имон Каванаг, Вильям О. Кирван, Генри Пол Редмонд, Джон Кевин Коллинс и Фергус Шанахан. Дифференцированный цитокиновый ответ дендритных клеток на комменсальные и патогенные бактерии в различных лимфатических компартментах у человека. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G839–G845, 2006. Впервые опубликовано 17 января 2005 года; ЦИО:10.1152/ajpgi.00112.2005 ‒ «Постоянное состояние микрофлоры хозяина и первичная иммунная система». Однако системные и слизистые иммунные реакции на бактерии могут различаться. Наша цель состояла в том, чтобы сравнить выработку in vitro цитокинов человеческими моноядерными и дендритными клетками (ДК) в брыжеечных лимфатических узлах (БЛУ) и мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) до определенных микробных стимулов. Мононуклеары и дендритные клетки, выделенные из БЛУ (n = 10) и периферической крови (n = 12) пациентов с активным колитом, инкубировали с пробиотическими бактериями Lactobacillus salivarius UCC118 или Bifidobacterium infantis 35624, или патогенным микроорганизмом Salmonella typhimurium UK1. Интерлейкин (ИЛ)-12, фактор некроза опухоли (ФНО)-, трансформирующий фактор роста (ТФР)- и ИЛ-10 количественно определяли с методом ИФА. МКПК и МКПК-производные ДК секретировали ФНО- в ответ на штаммы Lactobacillus, Bifidobacteria и Salmonella, тогда как БЛУ-клетки и БЛУ-производные ДК секретировали ФНО- только в ответ на воздействие Salmonella. Клетки из системного компартмента секретировали ИЛ-12 после совместной инкубации с Salmonella или Lactobacilli, тогда как клетки, полученные из БЛУ, продуцировали ИЛ-12 только в ответ на Salmonella. МКПК секретировали ИЛ-10 в ответ на штамм Bifidobacterium, но не в ответ на штамм Lactobacillus или Salmonella. Тем не менее клетки БЛУ секретировали ИЛ-10 в ответ на Bifidobacteria и Lactobacilli, но не в ответ на Salmonella. В заключение комменсальные бактерии индуцировали продукцию регуляторных цитокинов клетками БЛУ, тогда как патогенные бактерии индуцировали поляризующие цитокины Т-хелперов 1 типа. Дифференциация комменсальных патогенов в отношении цитокинового ответа более выражена в клетках, выделенных из иммунной системы слизистой оболочки, по сравнению с МКПК.

слизь; воспаление

НАУЧНОЕ ПОНИМАНИЕ желудочно-кишечной микрофлоры и ее взаимодействие с иммунным ответом хозяина в последнее время преуспело от сближения интереса с разрозненными традиционными исследовательскими дисциплинами. Это пробуждение интереса к кишечным бактериям объясняется несколькими факторами, включая открытие Helicobacter pylori как причины язвенной болезни и рака желудка, роль местной флоры в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), развитие культурально независимых молекулярных методов для изучения кишечных бактерий и все большее признание роли комменсальной флоры в развитии и тонкой настройке иммунного ответа слизистой (2, 16, 25, 27, 28). Ранние исследования с гнотобиотическими мышами, которые продемонстрировали важность колонизации бактерий в содействии развитию иммунного ответа, были дополнены современными молекулярными методами, включая лазерную диссекторную микроскопию, для идентификации молекулярных сигналов и путей трансдукции, лежащих в основе регуляторного влияния кишечной микрофлоры на структуру и функции иммунной системы слизистой оболочки (7, 8, 20). В то время как роль кишечного эпителия как датчика микробной среды в кишечнике хорошо установлена (15) и показаны дифференциальные эпителиальные реакции на комменсальные и патогенные сигналы, регионарную специализацию ответов лимфоидных клеток, ассоциированных с кишечником, на бактериальные сигналы сравнивали с системными иммунными ответами и этому уделяли меньше внимания. Хотя у мышей (11) была продемонстрирована специфическая для тканей специализация иммунологических реакций на патогены, в том числе подгруппы, специфичные для регионарных дендритных клеток (ДК), доказательство этого у людей встречается реже (31). Поэтому мы провели сравнительное исследование цитокиновых ответов лимфоидных популяций, включая изолированные ДК из брыжеечного лимфатического узла человека (БЛУ) и периферической крови. Результаты подтверждают различие цитокиновых ответов на комменсальные Lactobacilli и Bifidobacteria (по сравнению с патогенной Salmonella) и демонстрируют различные формы ответа в двух лимфоидных компартментах.

Популяция исследования. Это исследование было одобрено Комитетом по этике университетской клинической больницы Ирландского национального университета в Корке, и информированное согласие было получено от всех добровольцев. Исследовательская популяция включала пациентов с ВЗК, подвергшихся колэктомии или резекции тонкой кишки. БЛУ были получены от 10 пациентов с активным ВЗК [n = 10: возраст 19‒41 лет (в среднем ‒ 32,2 года), 3 женщины и 7 мужчин; 5 пациентов с болезнью Крона (БК) и 5 пациентов с язвенным колитом (ЯК)]. Всем пациентам были сделаны назначения, и они получали системные стероиды (5'-аминосалициловая кислота). Все пациенты нуждались в хирургическом вмешательстве из-за прогрессирующего заболевания и отсутствия ответа на лечение стероидами. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) были получены от пациентов с активным ВЗК (n = 12). Возрастной диапазон составлял 20‒51 год (в среднем ‒ 28 лет). В исследовании принимали участие пять женщин и семь мужчин; пять пациентов с БК и семь пациентов с ЯК. Ни один из доноров БЛУ и МКПК не был одним и тем же пациентом. Выделение клеток БЛУ. БЛУ были отобраны для этого исследования с тщательным учетом их анатомического расположения относительно очагов воспаления в кишечнике.
Выбранные БЛУ были непосредственно с наличием отделяемой воспаленной области кишечника. От трех пациентов в этой
исследуемой популяции удалось получить сегменты с дренируемым БЛУ из воспаленных и невоспаленных участков кишечника.
Одноклеточные суспензии были получены из БЛУ путем мягкой экструзии ткани через сетчатый фильтр размером 180 мкм. Клетки промывали и повторно растворяли в СИМД, содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки (ФТС; Инвитроген, Пейсли, Великобритания). Мононуклеарные клетки выделяли методом фиколл- пак центрифугирования в градиенте плотности (3) и повторно растворяли в концентрации 1 × 106 клеток/мл в полной среде СМИД, содержащей 25 мМ глюкозы, 10 % ФТС, 1 % заменимых аминокислот, 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Инвитроген). Эти мононуклеарные клетки называются клетками БЛУ (КБЛУ). Выделение МКПК. Периферическую кровь отбирали непосредственно в стерильные ЭДТА-содержащие вакуумные контейнеры. Мононуклеарные клетки выделяли из крови фиколл-пак центрифугированием в градиенте плотности. После этапа промывки МКПК повторно растворяли в полной среде в концентрации 1 × 106 клеток/мл.
Выделение ДК. ДК из БЛУ и периферической крови выделяли с использованием идентичных процедур. Клетки повторно растворяли в PBS в концентрации 5  107 клеток/мл (без Ca2+ или Mg2+) с 4 % ФТС. Для оптимального высвобождения ДК во все среды добавляли 1 мМ ЭДТА и суспензии клеток блокировали анти-CD32-антителами (СтемСелл, Мелан, Франция). ДК были выделены из этой клеточной суспензии в соответствии с протоколом изготовителя с использованием негативного изолирующего набора ДК (StemSep depletion cocktail, StemCell) ДК повторно растворяли в бессывороточной среде Stemspan (СтемСелл) в концентрации 1 × 106 клеток/мл. Жизнеспособность, определяемая вытеснением трипанового синего, была неизменно ≥ 98 %. Чистоту препаратов ДК оценивали методом проточной цитометрии. Клетки, которые были положительными к человеческому лейкоцитарному антигену (HLA)-DR и CD3/CD14/CD16/CD19/ CD20/CD56, назывались ДК. Все антитела были получены от компании БД Биосайнсис (Оксфорд, Великобритания). Бактериальные штаммы. Мы (5) ранее указывали критерии отбора для выделения Lactobacillus salivarius UCC118 и Bifidobacterium infantis 35624. L. salivarius и B. infantis были анаэробно культивированы в течение 24‒48 часов в среде МРС (Ман, Рогоза, Шарп) (МРС; Оксойд, Бэсингсток, Великобритания) и МРС, дополненной 0,05 % цистеином (Сигма, Дублин, Ирландия), соответственно. Salmonella typhimurium UK1 культивировали аэробно в течение 18‒24 ч в триптическом соевом бульоне (Оксойд). Бактериальные культуры собирали центрифугированием (3000 г  15 мин), промывали PBS и затем разбавляли до конечных плотностей
клеток 1 × 107, 1  105 и 1  103 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл в СИМД. Стимуляция клеток in vitro. Все клетки высевали в 24-луночные планшеты для культивирования (Костар, Шиполь-Рижк, Нидерланды) в количестве 1 × 106 клеток/мл. КБЛУ стимулировали в течение 72 ч с L. salivarius, B. infantis или S. typhimurium при трех различных концентрациях бактерий: 1  107, 1  105 и 1  103 КОЕ.

Поскольку 1  107 КОЕ/мл бактерий приводили к значительной стимуляции продукции цитокинов, эта бактериальная концентрация использовалась в последующих экспериментах. КБЛУ, выделенные из невоспаленного кишечника и МКПК, стимулировали в течение 72 ч этими бактериями при 1 × 107 КОЕ. ДК, выделенные из БЛУ и периферической крови, стимулировали L. salivarius, B. infantis или S. typhimurium. Культуры КБЛУ и МКПК оставались жизнеспособными в течение 72-часового периода культивирования (>95 % жизнеспособных через 72 часа). Жизнеспособность ДК быстро снижалась после 24-часовой инкубации, поэтому все стимуляции ДК прекращались через 24 часа (средняя жизнеспособность через 24 ч > 94 %, средняя жизнеспособность через 72 часа = 31 %). Для оценки спонтанных уровней секреции цитокинов присутствовали нестимулированные клетки. Планшеты инкубировали при 5 % СО2 и 37 °С увлажненной атмосферы, после чего супернатанты собирали для анализа цитокинов. Продукцию цитокинов измеряли в соответствии с инструкциями производителя, используя коммерчески доступные наборы ИФА («Р энд Д Системс», Абингдон, Великобритания).
Исследуемые цитокины включали фактор некроза опухоли (ФНО)-α, интерлейкин (ИЛ)-12 p40, ИЛ-10 и трансформирующий фактор роста (ТФР)-β.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов. После стимуляции МКПК с L. salivarius, B. infantis или S. typhimurium клетки исследовали методом проточной цитометрии на предмет экспрессии внутриклеточных цитокинов. Инкубации МКПК проводили в течение 3, 6 и 12 часов в присутствии Golgistop (БД «Биосайнсис»). Клетки окрашивали FITC- конъюгированными анти-CD3-антителами для идентификации Т- клеток, тогда как ДК были идентифицированы как отрицательные, CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56 (конъюгированные FITC), и положительные: Cy5-HLA-DR. Клетки фиксировали и пермеабилизировали с использованием набора Cytofix/Cytoperm (БД «Биосайнсис») с последующей совместной инкубацией с фикоэритрин конъюгированными антителами к ИЛ-10 или анти-ФНО-α. Все антитела были получены от компании БД «Биосайнсис». Проточный цитометрический анализ частоты клеток, проявляющих положительный цитокиновый ответ, проводили с использованием программного обеспечения BD FacsCalibur и Cell Quest Pro.
Статистический анализ. Результаты анализировали методом дисперсионного анализа. Показатели выражены как среднее значение ± СО. Статистически значимые различия в продукции цитокинов между нестимулированными клетками (контрольная группа) и клетками, стимулированными бактериями, принимались при P < 0,05.

Различные иммунные ответы КБЛУ на комменсальные и патогенные бактерии. Расхождение цитокиновых ответов между
штаммами (т. е. комменсальные бактерии против патогенных бактерий) наблюдалось в дренируемых КБЛУ из воспаленных и невоспаленных участков кишечника (рис. 1). L. salivarius и B. infantis индуцировали продукцию ИЛ-10 в КБЛУ при максимальном содержании бактерий (107 КОЕ). B. infantis также значительно индуцировала продукцию ТРФ-β, тогда как продукция ТРФ-β, индуцируемая L. salivarius, не достигла статистической значимости. L. salivarius и B. infantis не индуцировали ФНО-α или ИЛ-12. Напротив, S. typhimurium значительно индуцировала продукцию ИЛ-12 и ФНО-α в КБЛУ, но не индуцировала ИЛ-10 или ТРФ-β.
Чтобы подтвердить, что результаты не были искажены наличием воспаления в резецированных образцах, КБЛУ были выделены из двух разных дренажных областей (из воспаленных и невоспаленных сегментов), которые были доступны у трех пациентов с ограниченным распределением заболевания. Образцы ответа КБЛУ на комменсалы и патогены были одинаковыми, независимо от того, были ли они из участков, которые дренируют воспаленные или невоспаленные участки кишечника (рис. 2). Таким образом, штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium индуцировали продукцию ИЛ-10 и ТФР-β, тогда как штамм Salmonella индуцировал продукцию ИЛ-12 и ФНО-α. Однако в то время как картина цитокиновых ответов была сходной между КБЛУ с обоих участков, количество стимулированных S. typhimurium ИЛ-12 и ФНО-a, продуцируемых дренируемой областью воспаленного кишечника, было больше, чем уровней, продуцируемых дренируемыми КБЛУ из невоспаленного участка кишечника.
Сравнение цитокиновых ответов КБЛУ и МКПК. Цитокиновый ответ клеток, полученных из иммунного компартмента слизистой оболочки, на комменсальные бактерии не отражался в ответе клеток, полученных из системного компартмента (рис. 3). В то время как L. salivarius значительно индуцировала продукцию ИЛ-12 и ФНО-α при совместной инкубации с МКПК, эти цитокины не секретировались КБЛУ.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов. В стимулированных культурах МКПК как в T-клетки, так и ДК секретировали ИЛ-10 и ФНО-α в ответ на совместную инкубацию с каждым исследуемым бактериальным штаммом (рис. 4). Однако из этих гистограмм видно, что больший процент популяции ДК (положительные HLA-DR) продуцирует цитокины по сравнению с Т-клетками в тех же культурах. Это говорит о том, что ДК ответственны за большую часть цитокинов, высвобождаемых в супернатанты культур и определяемых методом ИФА.
Реакции цитокинов ДК на микробиологическое воздействие. Выделенные препараты ДК составляли постоянно >90 %
положительных HLA-DR и отрицательные CD3/CD14/CD16/CD19/ CD20/CD56 (среднее значение = 93,2±2,9 %). L. salivarius индуцировала секрецию ИЛ-10, ФНО-α и ИЛ-12 в ДК периферической крови и индуцировала только секрецию ИЛ-10 в ДК, полученных из БЛУ (рис. 5). B. Infantis индуцировала продукцию ИЛ-10 и ФНО-, но не индуцировала продукцию ИЛ-12 ДК периферической крови. B. infantis стимулировала продуцирование только ИЛ-10 в ДК, выделенных из БЛУ. S. typhimurium значительно индуцировала продукцию ИЛ-12 и ФНО-α как в ДК, выделенных из БЛУ, так и из периферической крови, но только индуцировала секрецию ИЛ-10 в ДК, выделенных из МКПК. Важно отметить, что абсолютные уровни цитокинов, вырабатываемых из ДК, были значительно меньше, чем выработка из популяций мононуклеарных клеток. Это может отражать различные периоды культивирования для ДК (24 ч) и популяций мононуклеаров (72 часа), но также предполагает, что отдельным субпопуляциям ДК необходимо взаимодействие с другими мононуклеарными клетками для достижения
оптимального ответа на бактериальное воздействие.

Ожидаются индивидуальные ответы на патогены и комменсальные бактерии, независимо от лимфоидного компартмента, и это очевидно в настоящем исследовании. Ожидаемый ответ цитокина на Salmonella, поляризованного Т-хелпером 1 типа (Th1), отмечался как для БЛУ, так и для периферической крови. Однако ответы in vitro на комменсальные бактерии расходились в двух лимфоидных компартментах. В то время как значительные уровни ФНО- продуцировались в ответ на штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium в МКПК и ДК, полученные из этого источника, БЛУ и ассоциированные с ними ДК не продуцировали этот цитокин в присутствии тех же микробных стимулов. Кроме того, соотношение продукции ИЛ-12 к ИЛ-10 периферическими клетками в ответ на L. salivarius полностью меняется в БЛУ.
Было показано, что БЛУ мышей ограничивает доступ слизистых ДК, несущих комменсальные бактерии, к системному иммунитету (17). Однако цитокиновые ответы ДК на комменсальные бактерии и патогены в пределах человеческого БЛУ ранее не изучались. Человеческий БЛУ является богатым хранилищем лимфоидных клеток, ассоциированных со слизистой оболочкой, и имеет преимущество, которое позволяет очищать ДК и другие клетки без использования
артифициальной искажающей переменной ввиду ферментативного переваривания тканей, что требуется для выделения клеток из собственной пластинки слизистой кишечника (12, 13, 26). Тем не менее доступ к человеческим БЛУ ограничен и в значительной степени зависит от доступности хирургического резецированного материала у пациентов, подвергшихся колэктомии при ВЗК или колоректальном раке. Чтобы избежать ненужных искажающих переменных, настоящее исследование было ограничено материалом пациентов с ВЗК, поскольку нами и другими авторами сообщалось о местной иммуносупрессии в дренируемых лимфоузлах, пораженных опухолью (24).
Брыжеечные узлы в дренажном поле желудочно-кишечных опухолей подвержены не только иммунодепрессивным эффектам неидентифицированных микрометастазов, которые не обнаруживаются обычной гистологией, но также подвергаются воздействию иммуносупрессорных факторов первичной опухоли. Однако расходящиеся результаты между брыжеечным и периферическим лимфоидными компартментами не были связаны с заболеванием, поскольку образцы с обоих участков были взяты у пациентов с активным заболеванием. Что еще более важно, мы воспользовались наличием дренируемых лимфоузлов с воспаленных и невоспаленных участков слизистой оболочки толстой кишки у трех пациентов, подвергшихся колэктомии при субтотальном поражении толстой кишки в результате ЯК. Результаты показали, что типы цитокиновых ответов на различные микробные стимулы были одинаковыми, независимо от того, находились ли узлы в области дренажа воспаленных или невоспаленных участков толстой кишки. Ранее сообщалось о поразительной изменчивости ответов ДК на различные микробные раздражители (4a, 9). Цитокиновые ответы ДК могут также варьироваться для разных видов бактерий одного и того же семейства (4). Индивидуальные цитокиновые ответы на разные микробы позволяют хозяину анализировать локальную среду и ощущать опасность. Эти сигналы опосредуются рядом рецепторов распознавания структур, включая толл-подобные рецепторы и лектины C-типа на поверхности ДК (1, 6, 19). Экспрессия этих рецепторов, вероятно, является различной в разных тканях. Другим фактором, который может влиять на продукцию цитокинов в различных лимфоидных компартментах, является доза бактерий, воздействию которой подвергается система. Изменчивость цитокиновых ответов может также отражать гетерогенность внутри популяций ДК. Таким образом, мышиные ДК из кишечных пейеровых бляшек обеспечивают больше ответов ИЛ-10, чем ИЛ-12 p40, тогда как последние более характерны для селезеночных ДК (10). Результаты настоящего исследования с человеческим БЛУ подтверждают данные, полученные на мышах, в отношении регионарной специализации ДК. Несмотря на это, степень, до которой можно экстраполировать различные виды, ограничена, поскольку нормальные ответы у мышей на кишечные антигены смещены в сторону профиля Th2, тогда как иммунные ответы слизистой оболочки человека, по-видимому, имеют смещение к Th1 (22). Транслокация бактерий является важной проблемой в клинической медицине и традиционно оценивается культивированием бактерий из БЛУ. Позже БЛУ были продемонстрированы как важные «гейткиперы», ограничивающие доступ бактерий к системному кровотоку (17). Результаты настоящего исследования имеют клиническое применение, поскольку комменсальные бактерии, в том числе изученные нами, были использованы в качестве пробиотиков на животных моделях ВЗК (18, 23) и используются в клинических испытаниях с участием человека (www.proeuhealth.vtt.fi). Является ли количество бактерий, используемых в наших исследованиях, клинически значимым ‒ неизвестно, но, вероятно, будет иметь значение в контексте клинических состояний с повышенной проницаемостью кишечника и высокой частотой развития сепсиса (например, ВЗК). Более того, количество бактерий, выделенных из периферической крови у экспериментально инфицированных животных, находится в диапазоне бактерий, изученных в данном исследовании (30). Наконец, мы (29) ранее продемонстрировали, что пробиотики, вводимые парентерально, оказывают благотворное влияние; поэтому важно понять, как иммунная система воспринимает их при различном расположении.
В этом отношении следует отметить, что, хотя известно, что Lactobacilli стимулируют ответы ИЛ-12 из периферической крови человека (21), более релевантные ответы, вероятно, связаны с кишечно- ассоциированной лимфоидной тканью. В отличие от периферической крови регуляторные цитокины, такие как ИЛ-10 и ТФР-β, продуцировались вместо ФНО-α и ИЛ-12 после того, как клетки подвергались воздействию Lactobacilli и Bifidobacteria in vitro. В заключение регионарная специализация иммунных реакций на микробные стимулы доказана у людей. В дополнение к поляризованным ответам на комменсальные бактерии и патогенные микроорганизмы в периферической крови и брыжеечных лимфоидных клетках существуют разные ответы на микробное воздействие. Это следует учитывать при интерпретации иммунологических ответов на комменсальные или пробиотические микроорганизмы у людей.

Авторов частично поддерживали Научный фонд Ирландии в форме гранта центра (Центр алиментарной фармабиотики), Ирландский совет по исследованиям в области здравоохранения, Управление высшего образования Ирландии, а также ЕС ‒ посредством гранта в области исследования пробиотиков и заболеваний желудочно-кишечного тракта QLK-2000-00563.

Л. О'Махони, Дж. К. Коллинс и Ф. Шанаханг являлись сотрудниками многопрофильной компании на территории университетского кампуса («Алиментари Хелс Лимитед»), которая исследует взаимодействия микрофлоры хозяина и терапевтическое управление этими взаимодействиями при различных заболеваниях человека и животных. Содержание этой статьи не подвергалось ни влиянию, ни ограничению данным фактом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Akira S, Takeda K, and Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immun 2: 675‒680, 2001.
2. Berg RD. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol 4: 430‒435, 1996.
3. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest 97: 7, 1968.
4. Christensen HR, Frokiaer H, and Pestka JJ. Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J Immunol 168: 171‒178, 2002.
4a. De Jong EC, Vieira PL, Kalinski P, Schuitemaker JH, Tanaka Y, Wierenga EA, Yazdanbakhsh M, and Kapsenberg ML. Mcrobial compounds selectively induce Th1 cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells in vitro with diverse Th cell-polarizing signals. J Immunol 168: 1704‒1709, 2002.
5. Dunne C, Murphy L, Flynn S, O'Mahony L, O'Halloran S, Feeney M, Morrissey D, Thorton G, Fitzgerald G, Daly C, Kiely B, Quigley EM, O'Sullivan GC, Shanahan F, and Collins JK. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Antonie Van Leeuwenhoek 76: 279‒292, 1999.
6. Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Adema GJ, van Kooyk Y, and Figdor CG. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cellspecific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100: 575‒585, 2000.
7. Hooper LV and Gordon JI. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science 292: 1115‒1118, 2001.
8. Hooper LV, Wong MH, Thelin A, Hansson L, Falk PG, and Gordon JI. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science 291: 881‒884, 2001.
9. Huang Q, Liu D, Majewski P, Schulte LC, Korn JM, Young RA, Lander ES, and Hacohen N. The plasticity of dendritic cell responses to pathogens and their components. Science 294: 870‒875, 2001.
10. Iwasaki A and Kelsall BL. Freshly isolated Peyer's patch, but not spleen, dendritic cells produce interleukin 10 and induce the differentiation of T helper type 2 cells. J Exp Med 190: 229‒239, 1999.
11. Iwasaki A and Kelsall BL. Unique functions of CD11b+, CD8 alpha+, and double-negative Peyer's patch dendritic cells. J Immunol 166: 4884‒4890, 2001.
12. James SP, Graeff AS, and Zeitz M. Predominance of helper-inducer T cells in mesenteric lymph nodes and intestinal lamina propria of normal nonhuman primates. Cell Immunol 107: 372‒383, 1987.
13. James SP, Graeff AS, Zeitz M, Kappus E, and Quinn TC. Cytotoxic and immunoregulatory function of intestinal lymphocytes in Chlamydia trachomatis proctitis of nonhuman primates. Infect Immun 55: 1137‒1143, 1987.
15. Kagnoff MF and Eckmann L. Epithelial cells as sensors for microbial infection. J Clin Invest 100: 6‒10, 1997.
16. MacDonald TT and Pattersson S. Bacterial regulation of intestinal immune responses. Inflammatory Bowel Dis 6: 116‒122, 2000.
17. Macpherson AJ and Uhr T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science 303: 1662‒1665, 2004.
18. McCarthy J, O'Mahony L, O'Callaghan L, Sheil B, Vaughan EE, Fitzsimons N, Fitzgibbon J, O'Sullivan GC, Kiely B, Collins JK, and Shanahan F. Double blind, placebo controlled trial of two probiotic strains in interleukin 10 knockout mice and mechanistic link with cytokine balance. Gut 52: 975‒980, 2003.
19. Medzhitov R and Janeway C. The toll receptor family and microbial recognition. Trends Microbiol 452: 8, 2000.
20. Midtvedt T. Microbial functional activities. In: Intestinal Microflora, edited by Hanson LA and Yolken RH. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1999.
21. Miettinem M, Matikainen S, Vuopio-Varkila J, Pirhonen J, Varkila K, Kurimoto M, and Julkunen I. Lactobacilli and streptococci induce interleukin-
12 (IL-12), IL-18, and gamma interferon production in human peripheral blood mononuclear cells. Infect Immun 66: 6058–6062, 1998.
22. Nagata S, McKenzie C, Pender SL, Bajaj-Elliott M, Fairclough PD, Walker-Smith JA, Monteleone G, and MacDonald TT. Human Peyer's patch T cells are sensitized to dietary antigen and display a Th cell type 1 cytokine profile. J Immunol 165: 5315–5321, 2000.
23. O'Mahony L, Feeney M, O'Halloran S, Murphy L, Kiely B, Fitzgib-bon J, Lee G, O'Sullivan G, Shanahan F, and Collins JK. Probiotic impact on microbial flora, inflammation and tumour development in IL-10 knockout mice. Aliment Pharmacol Ther 15: 1219–1225, 2001.
24. O'Sullivan GC, Corbett AR, Shanahan F, and Collins JK. Regional immunosuppression in esophageal squamous cancer: evidence from functional studies with matched lymph nodes. J Immunol 157: 4717–4720, 1996.
25. Rook GAW and Stanford JL. Give us this day our daily germs. Immunol Today 19: 113–116, 1998.
26. Schoeffel U, Pelz K, Haring RU, Amberg R, Schandl R, Urbaschek R, von Specht BU, and Farthmann EH. Inflammatory consequences of the translocation of bacteria and endotoxin to mesenteric lymph nodes. Am J Surg 180: 65–72, 2000.
27. Shanahan F. Mechanisms of immunological sensation of intestinal contents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 278: G191–G196, 2000.
28. Shanahan F. The host-microbe interface within the gut. Best Practice Res Clin Gastroenterol 16: 915–931, 2002.
29. Sheil B, McCarthy J, O'Mahony L, Bennett MW, Ryan P, Fitzgibbon JJ, Kiely B, Collins JK, and Shanahan F. Is the mucosal route of administration essential for probiotic function? Subcutaneous administration is associated with attenuation of murine colitis and arthritis. Gut 53: 694–700, 2004.
30. Sommerfield D, MacSharry J, O'Mahony D, O'Mahony L, Kiely B, Shanahan F, and Quigley E. Effect of probiotic feeding on Salmonella translocation in a mouse model. Gastroenterology 128, Suppl 2: A120–A120, 2005.
31. Stagg AJ, Hart AL, Knight SC, and Kamm MA. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut 52: 1522–1529, 2003.