Патриция Коньецна1, Дэвид Грогер2, Марио Зиглер1, Ремо Фрай1, Рут Ферстл1, Фергус Шанахан3, Имонн М. М. Куигли3, Барри Кили2, Цезми А. Акдис1, Лиам О'Махони1

Основной гомеостаз кишечника зависит от иммунологической толерантности к микробиоте.
Цель: (1) определить, может ли пробиотик индуцировать Т-клетки Foxp3 у людей; (2) изучить молекулярные механизмы, которые участвуют в индукции Т-клеток Foxp3 дендритными клетками человека.
Дизайн: секрецию цитокинов и экспрессию Foxp3 оценивали у добровольцев после добавки к рациону Bifidobacterium infantis. Дендритные клетки моноцитарного происхождения (ДКМП), миелоидные дендритные клетки (МДК) и плазмоцитоидные дендритные клетки (ПДК) инкубировали in vitro с использованием B infantis и аутологичных лимфоцитов. Были проанализированы экспрессия фактора транскрипции, экспрессия костимулирующей молекулы, секреция цитокинов, метаболизм ретиноевой кислоты и триптофана.
Результаты: добровольцы, получавшие B infantis, демонстрировали избирательное увеличение секреции интерлейкина (ИЛ)-10 и усиление экспрессии Foxp3 в периферической крови. In vitro, ДКМП, МДК и ПДК экспрессировали 2,3-диоксигеназу индоламина и секретировали ИЛ-10, но не ИЛ-12p70 в ответ на воздействие B infantis. Секреция ИЛ-10 клетками ДКМП и МДК была зависима от толл-подобного рецептора (ТПР)-2/6, тогда как секреция ИЛ-10 клетками ПДК была зависима от ТПР-9. Кроме того, ДКМП и МДК экспрессировали РАЛДГ2 (RALDH2), которая была зависима от ТПР-2 и молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина (DC-SIGN). ДКМП, МДК и ПДК, стимулируемые B infantis, индуцировали экспрессию T-клеток Foxp3. ТПР-2, молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина и ретиноевая кислота были необходимы для индукции Т-клеток Foxp3 клетками ДКМП и МДК, тогда как для ПДК была необходима 2,3-диоксигеназа индоламина.
Выводы: введение B infantis человеку выборочно стимулирует иммунорегуляторные ответы, предполагая, что этот микроорганизм может оказывать лечебный эффект у пациентов с воспалительными заболеваниями. Перекрестное действие между некоторыми рецепторами распознавания структур и метаболическими механизмами определяет врожденный и последующий регуляторный ответ Т-клетки на воздействие B infantis. Эти данные свидетельствуют о взаимосвязи питания, микробиоты и индукции толерантности к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта.

Что уже известно по данной теме?
► Комменсальная микробиота важна для гомеостаза кишечника.
► Т-регуляторные клетки необходимы для развития кишечной толерантности.
► Дендритные клетки индуцируют Т-регуляторные клетки в кишечнике.
► Модели мышей показывают, что взаимодействие микробиото-дендритных клеток индуцирует Т-регуляторные клетки. Каковы новые полученные результаты?
► Добавление Bifidobacterium infantis к рациону индуцирует Т-клетки Foxp3 и секрецию интерлейкина (ИЛ)-10 мононуклеарной клетки периферической крови у людей.
► Дендритные клетки человека, стимулируемые B infantis, индуцируют секретирующие Т-клетки Foxp3 и ИЛ-10.
► Подмножества дендритных клеток используют разные рецепторы распознавания структур, чтобы индуцировать Т-регуляторные клетки.
► Метаболические реакции дендритных клеток (т. е. метаболизм ретиноевой кислоты и триптофана) имеют важное значение.
Как это может повлиять на клиническую практику в обозримом будущем?
► Применение B infantis будет включено в интервенционные подходы обеспечения максимальной толерантной иммуномодулирующей активности в кишечнике с целью профилактики воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте.Лечение пациентов с СИБР заключается в устранении избыточного бактериального обсеменения тонкой кишки, восстановлении микробиоценоза кишечника, нормализации кишечного пищеварения. Кроме того, параллельно проводится симптоматическое лечение, направленное на ликвидацию или уменьшение выраженности основных симптомов заболевания. Во многих случаях на первый план выступает терапия, направленная на устранение основной причины заболевания [1]. Основой лечения данного синдрома является назначение антибактериальных препаратов широкого спектра, эффективных против анаэробных бактерий, – рифаксимина (внутрь по 400–600 мг 2 раза в сутки), метронидазола (внутрь по 500 мг 3 раза в сутки), ципрофлоксацина (внутрь по 500 мг 2 раза в день), норфлоксацина (внутрь по 800 мг/сут), ванкомицина (внутрь по 125 мг 4 раза в день) [1–3]. Иногда требуется проведение повторных курсов продолжительностью от 7 до 14 дней.

Комменсальная микробиота необходима для оптимального развития хозяина и для текущего гомеостаза в кишечнике, который отображает взаимозависимость между микроорганизмами и иммунитетом.1–3 Это требует сигнальных ответов на введение комменсальных микроорганизмов по сравнению с патогенами для обеспечения толерантности и защитного иммунитета соответственно.
Характерной особенностью толерантности к слизистой является индукция и распределение регуляторных Т-клеток Foxp3, которые препятствуют избыточному развитию провоспалительных реакций.4, 5 Мы и другие авторы идентифицировали специфические микроорганизмы, которые избирательно способствуют поляризации Foxp3 в слизистой оболочке кишечника мышей.6–10 Кроме того, результаты недавних исследований у пациентов с воспалительными заболеваниями (язвенный колит и аллергия) указывают на то, что получение с питанием специфических терапевтических микроорганизмов может увеличить долю CD25высок. T-клеток.11, 12 Однако механизмы in vivo, подтверждающие связанное с микробиотой влияние на регуляторные Т-клетки, недостаточно изучены, остается неясным, применимы ли к людям механические результаты, полученные на мышиных моделях.
Внутри слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта в поддержании гомеостаза и толерантности кишечника участвует ряд клеток, включая эпителиальные клетки, интраэпителиальные лимфоциты, макрофаги собственной пластинки и дендритные клетки.13 В частности, как миелоидные (МДК), так и плазмоцитоидные дендритные клетки (ПДК) находятся в тесном взаимодействии с микроорганизмами и отвечают за представление микробных и пищевых антигенов адаптивной иммунной системе, тем самым влияя на поляризацию адаптивного ответа с помощью цитокинов и продуктов метаболизма.14–18 Таким образом, механизм индукции Т-клеток Foxp3 находится под значимым влиянием активации рецепторов распознавания структур ДК (РРС), которые программируют экспрессию ДК-гена и последующую поляризацию Т-клеток.19 Координация между сигнальными путями РРС важна для индукции соответствующего ответа ДК и T-клеток. Например, распознавание толл-подобного рецептора (ТПР-2) зимозана приводит к секреции ретиноевой кислоты и интерлейкина (ИЛ)-10, приводящей к индукции Foxp3, тогда как активация актином-дектином-1 зимозаном приводит к секреции ИЛ-23 и индукции Тх17.20 Кроме того, было показано, что активация ТПР-2 подавляет связанные с ТПР-3 воспалительные реакции внутри кожи с помощью механизма, зависимого от ассоциированного с ФНО фактора-1.21 Кроме того, подмножества ДК могут использовать различные молекулярные механизмы для взаимодействия в ходе индукции Т-регуляторных клеток.22, 23 Bifidobacterium longum, подвиды infantis 35624 (B infantis), представляют собой комменсальный микроорганизм, первоначально выделенный из слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта человека и широко изучаемый в отношении его способности регулировать воспалительные реакции как у мышей, так и у человека.6, 24–30 Мы выбрали эту бактерию в качестве вероятного претендента на способность индуцировать лейкоцитарные Т-регуляторные клетки у людей. Наши результаты показывают, что значительно более высокие показатели ответов ИЛ-10 и экспрессии Foxp3 наблюдаются у людей после воздействия B infantis in vivo при пероральном применении. Кроме того, мы предоставляем доказательства потенциальных клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого регуляторного эффекта, поскольку как МДК человека, так и ПДК специально индуцируют Foxp3 + CD4 + клетки после инкубации in vitro с B infantis. Однако механизмы индукции Foxp3 различаются для МДК и ПДК. Индукция Т-клеток Foxp3 с помощью МДК связана с ТПР-2-, молекулами межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина и ретиноевой кислотой, тогда как индукция клеток Foxp3 с помощью pПДК требует индоламина 2,3-диоксигеназу (ИДО).

Клинические исследования на людях
Было проведено два исследования с участием здоровых добровольцев, оба они были одобрены комитетом по этике клинических исследований в Университетских клинических больницах в Корке, Ирландия. Каждый потенциально подходящий здоровый взрослый доброволец оценивался путем тщательного обзора истории болезни, физикального осмотра, гематологического и биохимического анализов. Клинически значимые результаты по любому из параметров оценки привели к исключению этого добровольца. В первом исследовании здоровые взрослые были рандомизированы для получения B infantis (n = 10, 1х109 живых бактерий в день) или плацебо (n = 12, криозащита без бактерий) в течение 8 недель. Все исследователи, а также добровольцы до завершения исследования не знали о рандомизации. Второе исследование проводилось с участием здоровых взрослых, которые отвечали тем же критериям отбора, что были представлены выше, но в этом исследовании все испытуемые получали B infantis (n = 17; 1х109 живых бактерий в день) в течение 8 недель. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли в день 1 (перед кормлением) и в день 56 (после кормления). Свежевыделенные МКПК окрашивали моноклональными антителами к CD4-PerCP, CD25-APC, ICOS-PE, CTLA-4-PE и Foxp3-Alexa Fluor 488 (еБиосайнс, Сан-Диего, Калифорния, США).
Дублированные образцы оценивали с использованием FACSCalibur (Бектон Дикинсон, Оксфорд, Англия), анализ проводился с использованием программного обеспечения BD CellQuest. Кроме того, 1х106 клеток/мл МКПК стимулировали антителами к CD3 (5 мкг/мл) и CD28 (5 мкг/мл) в течение 48 часов. Всплывшие МКПК анализировали в отношении уровня цитокинов одновременно с использованием мультиплексной платформы MesoScale Discovery.

Выделение дендритных клеток и условия культивирование
Изучение дендритных клеток проводили с использованием клеток, выделенных у интактных здоровых добровольцев (т. е. не получавших B infantis). Моноциты периферической крови человека были получены с использованием CD14 положительной изоляции с помощью системы MACS (Милтений Биотек, Бергиш-Гладбах, Германия). Клетки культивировали в среде cRPMI (Инвитроджен, Карлсбад, США) с 1000 ЕД/мл ИЛ-4 (Новартис, Базель, Швейцария) и 1000 ЕД/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ПепроТек, Лондон, Великобритания) в течение 5 дней для получения дендритных клеток моноцитарного происхождения (ДКМП). МДК периферической крови выделяли после истощения CD3, CD14, CD19 и позитивного отбора CD1с с помощью системы MACS. ПДК периферической крови были позитивно отобраны путем изоляции CD304 с помощью системы MACS. Кроме того, сортировка методом проточной цитометрии с анти-CD123 FITC (Милтений Биотек) дала высокоочищенную популяцию ПДК. Клетки CD4 периферической крови выделяли путем негативного отбора с помощью системы MACS. ДКМП, МДК и ПДК обычно культивировали в среде cRPMI и стимулировали бактериальными штаммами или оставляли без стимуляции. Для блокирующих экспериментов дендритные клетки предварительно инкубировали в течение 30 мин с контрольным олигонуклеотидом GCTAGATGTTAGCGT, олигонуклеотидом ТПР9-антагонистом TTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (Микросинт, Бальгах, Швейцария) или блокирующими моноклональными антителами: анти-ТПР2 (подарок от C Киршнинг, Мюнхен, Германия), антимолекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина (АЗДН1, Бекмен Культер, Бреа, США) и контрольное антитело IgG2B (Р и Д Системс Юорэп, Эбингдон, Великобритания). Секрецию цитокинов определяли количественным методом с помощью мультиплексной суспензии Bio-Plex (Био-Рад Лабораторис, Геркулес, США).

Мечение бактерий и визуализация связывания клеток
B infantis окрашивали диацетатом карбоксифлуоресцеина, сукцинимидиловым сложным эфиром карбоксифлуоресцеина (СМЭКФ) (Инвитроген), в то время как ДКМП были окрашены анти-CD11c PE-Cy5 (БД Фарминген, Франклин-Лейкс, США). ДКМП были визуализированы в нескольких временных точках с помощью мультиспектральной визуализирующей проточной цитометрии изображений Image Stream X (Эмнис Корпорэйшн, Сиэтл, США), изображения анализировали с использованием программного обеспечения IDEAS (Эмнис Корпорэйшн). Экспрессию CD80 FITC и CD86 PE (ЮД Фарминген) оценивали с помощью проточной цитометрии (Галлиос систем, Бекмен Культер, Ньон, Швейцария). ДКМП инкубировали с СМЭКФ-окрашенной B infantis в течение 16 ч, а локализацию B infantis в активированных лизосомах определяли окрашиванием ДКМП с красным DND-99 Lysotracker (Инвитроген) и DAPI в пролонгированном реагенте ProLong Gold (Инвитроген). Слайды анализировали методом конфокальной микроскопии.

Оценка РАЛДГ
ДКМП, МДК и ПДК стимулировали бактериями (с ингибиторами или без них) в течение 16–24 часов в среде cRPMI. Активность РАЛДГ определяли с использованием набора ALDEFLOUR (Альдаген, Дюрхэм, США), а позитивные клетки визуализировали с помощью проточной цитометрии. В показательных экспериментах ДКМП инкубировали с PKH26-окрашенной B infantis для совместной локализации бактериального связывания и индукции РАЛДГ.

Клетки HEK-293 TПР-2
Клетки HEK-Blue hTLR-2 и клетки HEK-Blue Null1 (Инвивоген, Сан- Диего, США) стимулировали B infantis в течение 24 часов. Обе клеточные линии экспрессируют репортер эмбриональной щелочной фосфатазы, секретируемый под воздействием ядерного фактора «каппаби». В качестве положительного контроля использовали лиганд ТПР-2 Pam3CSK4 (2,5 мкг/мл, Кальбиохем, Мерк КГаА, Дармштадт, Германия).

Сокультуры Т-клеток дендритных клеток
Дендритные клетки стимулировали в течение 4 ч тестируемыми бактериальными штаммами и совместно культивировали с аутологичными CD4-Т-клетками в соотношении 1:40 (МДК) или 1:20 (ДКМП и ПДК) в средах AIM-V (Инвитроген). Через 5 дней клетки повторно стимулировали анти-CD28 (генерировали в домашних условиях), анти-CD3 (Ортоклон OKT3, Янссен-Силаг) и анти-CD2 (Санкуин, Амстердам, Нидерланды). Через два дня лимфоциты пермеабилизировали и окрашивали для CD4, CD25 и Foxp3 (еБиосайнс). В качестве ингибиторов РАЛДГ2 и ИДО были добавлены Цитраль (Сигма-Алдрич, Сент-Луис, США), LE135 (Токрис Биосайнс, Бристоль, Великобритания) и 1-метил-L-триптофан (Сигма-Алдрич). Статистический анализ

Критерий Уилкоксона или критерий
Стьюдента использовали для оценки влияния ингибиторов in vitro на активированные дендритные клетки и дендритные клеточно-Т-клеточные сокультуры. Кроме того, оценка критериев нормальности Д'Агостино и Пирсона проводилась на
цитокине и проточных цитометрических данных в ходе исследований с участием добровольцев. Измерения до и после приема пищи оценивали с использованием критерия Стьюдента для парных данных, тогда как сравнения между лечебными группами и группами плацебо выполнялись с использованием критерия Стьюдента (двухсторонний) и
критерия Манна-Уитни. Весь анализ данных проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Добавление B infantis к питанию добровольцев связано с индукцией ИЛ-10 и клеток Foxp3 in vivo Здоровые добровольцы получали B infantis или плацебо в течение 8 недель. МКПК выделяли до и после периода приема пищи. Введение B
infantis было связано со значительно повышенными уровнями ИЛ-10 в стимулированных МКПК с помощью анти-CD3/CD28 (p = 0,01), тогда как уровни ИЛ-10 в группе плацебо не изменялись (p = 0,64, рис. 1A).

B infantis способствует созреванию и регуляции активности ДК
Чтобы понять, как B infantis индуцирует поляризацию ИЛ-10 и экспрессию клеток Foxp3 у людей, мы уделили особое внимание ДК как потенциальным клеточным медиаторам, которые могли бы взаимодействовать с B infantis in vivo в слизистой оболочке и секретировать иммунорегуляторные факторы, которые индуцируют поляризацию Т-клеток. ДКМП у человека, непосредственно выделенные человеческие МДК и ПДК были показаны in vitro для связывания B infantis (рис. 4A, B). Кроме того, ДКМП были способны поглощать этот микроорганизм (рис. 4C). Дозозависимое созревание
ДКМП было очевидно, исходя из увеличения экспрессии CD80 и CD86 (рис. 4D). Отмечалось аналогичное увеличение экспрессии костимулирующей молекулы миелоидной дендритной клетки (МДК) (результаты не показаны).
B infantis стимулировали ДКМП, МДК и ПДК, секретирующие ИЛ- 10, но не ИЛ-12p70 в ответ на введение этого микроорганизма (рис. 5A– C). Не со всеми Bifidobacteria отмечалось, как ДКМП секретировали ИЛ-12p70 при совместной инкубации с другими несвязанными штаммами Bifidobacteria и патогенными бактериями, такими как Streptococcus pyogenes, Staphyloccus aureus и Pseudomonas aeruginosa (дополнительный рис. S1).

Мы провели второе исследование с участием большого числа здоровых добровольцев, в которых мы переоценивали уровни ИЛ-10 в МКПК по сравнению с предыдущими данными, кроме того, мы количественно определяли экспрессию Foxp3. Мы снова наблюдали такое же увеличение анти-CD3/CD28-индуцированной МКПК-секреции ИЛ-10 (p < 0,001; рис. 1B), в то время как мы не наблюдали различий в анти- CD3/CD28-стимулированной секреции ИЛ-2, ИЛ-12p70, фактора
некроза опухоли (ФНО) α или интерферона (ИФН) γ (рис. 1C). Кроме того, процент клеток CD4 периферической крови, которые экспрессируют Foxp3, был значительно увеличен после введения B infantis с пищей (неделя 0 CD4 + Foxp3 + клетки = 8,14 ± 0,25 % по сравнению с неделей 8 CD4 + Foxp3 + клетки = 9,19 ± 0,34 %, p = 0,003).
Увеличенная экспрессия Foxp3 наблюдалась в CD25высоких и CD25промежуточных CD4-T-клетках, но не в CD25-T-клетках (рис. 2).
Клетки CD4 + CD25 + Foxp3 проявляли более выраженный регуляторный фенотип после введения B infantis, поскольку
индуцируемый Т-клеточный костимулятор (ИКОС) был выражен значительно большим количеством этих клеток на 8-й неделе (рис. 3).
Также увеличилась экспрессия цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (ЦТЛА-4), но разница не достигла статистической значимости (рис. 3, р = 0,06).

B infantis способствует созреванию и регуляции активности ДК
Чтобы понять, как B infantis индуцирует поляризацию ИЛ-10 и экспрессию клеток Foxp3 у людей, мы уделили особое внимание ДК как потенциальным клеточным медиаторам, которые могли бы взаимодействовать с B infantis in vivo в слизистой оболочке и секретировать иммунорегуляторные факторы, которые индуцируют поляризацию Т-клеток. ДКМП у человека, непосредственно выделенные человеческие МДК и ПДК были показаны in vitro для связывания B infantis (рис. 4A, B). Кроме того, ДКМП были способны поглощать этот микроорганизм (рис. 4C). Дозозависимое созревание ДКМП было очевидно, исходя из увеличения экспрессии CD80 и CD86 (рис. 4D). Отмечалось аналогичное увеличение экспрессии
костимулирующей молекулы миелоидной дендритной клетки (МДК) (результаты не показаны). B infantis стимулировали ДКМП, МДК и ПДК, секретирующие ИЛ- 10, но не ИЛ-12p70 в ответ на введение этого микроорганизма (рис. 5A– C). Не со всеми Bifidobacteria отмечалось, как ДКМП секретировали ИЛ-12p70 при совместной инкубации с другими несвязанными
штаммами Bifidobacteria и патогенными бактериями, такими как Streptococcus pyogenes, Staphyloccus aureus и Pseudomonas aeruginosa (дополнительный рис. S1).

В дополнение к регуляторным цитокинам B infantis индуцировала экспрессию гена АЛДГ1А2 (ALDH1A2), которая кодирует фермент ретинальдегид дегидрогеназы 2 (РАЛДГ2), в ДКМП и МДК, но не ПДК (рис. 5D).
АЛДГ1А2 индуцировался в ДКМП, а АЛДГ1А2 индуцировался позднее в МДК. B infantis не изменяла экспрессию гена
AЛДГ1A1 или АЛДГ1A3 в любом подвиде ДК (результаты не показаны). Функциональная активность РАЛДГ2 была подтверждена в ДКМП и МДК с помощью проточной цитометрии (рис. 5E). Ингибирование активности RALDH диэтиламинобензальдегидом полностью блокировало обнаружение BODIPY-аминоацетат-положительных клеток. Однако ПДК не способствовали активации RALDH при инкубации с B infantis (рис. 5E). ДКМП, которые связывались с B infantis, показали более высокий уровень метаболической активности RALDH, чем ДКМП, которые не захватывали B infantis
(дополнительный рис. S2A, B).
Кроме того, индукция RALDH зависела от дозы и в последующих экспериментах использовалась оптимальная доза приблизительно 5х106 бактериальных клеток (10:1 бактерий: число клеток ДКМП) (дополнительный рис. S2C). Другим метаболическим ферментом с регуляторной активностью является ИДО. B infantis индуцировала экспрессию гена ИДО в ДКМП, МДК и ПДК с относительно более высокими уровнями экспрессии ПДК (рис. 5F). Кинетика индукции ИДО была различной для каждого подвида ДК. Экспрессия ДКМП медленно увеличивалась с течением времени, в то время как уровень экспрессии МДК становился максимальным через 6 часов, и экспрессия поддерживалась на этом уровне с течением времени. Аналогично экспрессия ИДО ПДК достигала максимума через 6 часов, но затем
быстро снижалась.
Индукция АЛДГ1А2 в ДКМП, полученная под действием B infantis 35624, не наблюдалась при воздействии других изученных штаммов Bifidobacteria (дополнительный рис. S3A), в то время как экспрессия гена ИДО усиливалась липополисахаридом и всеми тремя штаммами Bifidobacteria (дополнительный рис. S3B).

Активация B infantis с помощью ДК зависит от РСС
Чтобы лучше понять молекулярную основу иммунорегуляторных ответов ДК, индуцируемых B infantis, мы в дальнейшем изучили роль РСС в данном процессе. ДКМП выражают высокие уровни Дектин-1; однако для ИЛ-10 (1626 ± 453 пг/мл против 1522 ± 418 пг/мл) или ИЛ- 12p70 (12,5 ± 4,8 пг/мл против 11,9 ± 4,1 пг/мл) не наблюдалось значительных различий в отношении продуцирования цитокинов с ингибированием Дектин-1. Блокирование ТПР-2 в ДКМП приводило к значительному уменьшению секреции ИЛ-10 и значительному увеличению секреции ИЛ-12p70 и ФНОα (рис. 6A). Ингибирование молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина в ДКМП не приводило к существенному изменению секреции ИЛ-10 или ИЛ-12, хотя секреция ФНОα значительно увеличилась (рис. 6A). Блокирование ТПР-2 и молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина в МДК
приводило к значительному уменьшению секреции ИЛ-10, связанной с повышенной секрецией ФНОα (рис. 6B). Чтобы подтвердить, что ТПР-2 индуцировал внутриклеточный сигнальный каскад в ответ на B infantis, мы исследовали клетки HEK-293, которые были изобретены для экспрессии ТПР-2.
Клетки HEK-293ТПР-2+ реагировали на введение B infantis, что было продемонстрировано увеличением активации ядерного фактора «каппаби» (NF-kB) и секреции ИЛ-8 (дополнительный рис. S4). Напротив, активация ядерного фактора «каппа-би» и секреция ИЛ-8 не увеличивались по сравнению с исходными уровнями в клетках HEKТПР-2. Кроме того, предварительная инкубация клеток HEK-293ТПР-2+ с блокирующим антителом против ТПР-2 приводила к значительному
уменьшению ядерного фактора «каппа-би» и секреции ИЛ-8 в ответ на воздействие B infantis. ТПР-2 может образовывать гетеродимеры с ТПР- 1 или ТПР-6. Блокирование ТПР-1 не влияло на активацию ядерного фактора «каппа-би» или секрецию ИЛ-10, вызванных B infantis, тогда как ТПР-6 оказывал частичный эффект, но не столь значимый, как
блокирование ТПР-2 (дополнительный рис. S5). Комбинация антител к ТПР-2 и к ТПР-6 была наиболее эффективной при ингибировании активации HEK-293 ядерного фактора «каппа-би» и секреции ИЛ-10 в ДКМП. ПДК выделяли ТПР-2 на очень низком уровне, и эксперименты по блокированию не влияли на выделение ИЛ-10 в ПДК в ответ на воздействие B infantis (рис. 6C), тогда как ИЛ-12p70 не обнаруживался.
Однако блокирование ТПР-9 ингибирующим олигонуклеотидом нейтрализовало секрецию ИЛ-10 в ПДК в ответ на воздействие B infantis (рис. 6D). Чтобы оценить, реагируют ли ПДК аналогичным образом конкретным агонистам ТПР-9, ПДК стимулировали с помощью CpG или B infantis. И стимуляция B infantis и CpG приводила к усилению экспрессии гена ИЛ-10 и ИДО, тогда как экспрессия гена ИФНα только увеличивалась после стимуляции CpG (рис. 6E). ДКМП и МДК выделяют очень низкие уровни ТПР-9, ТПР-9 ингибирующие олигонуклеотиды не изменяли ответ ДКМП на воздействие B infantis (результаты не показаны).
В дополнение к продукции цитокинов блокирование ТПР-2 или молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина в ДКМП приводило к значительному ингибированию метаболизма ретиноевой кислоты в ДЕМП и МДК, стимулированных B infantis (рис. 7A, B). Более того, специфическая активация ТПР-2 в ДКМП под действием Pam3CSK4 вызывала метаболизм ретиноевой кислоты, тогда как стимуляция молекул межклеточной адгезии
дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина маннозилированным липоарабиноманнаном (МанЛам) незначительно
увеличивала метаболизм ретиноевой кислоты (рис. 7C). Напротив, специфическая активация ТПР-4 или ТПР-5 липополисахаридом или флагеллином, соответственно, не вызывала метаболизма ретиноевой кислоты в ДКМП (рис. 7C).

ДК, стимулируемые B infantis, индуцируют Т-клетки Foxp3
Поскольку человеческие ДК четко выделяют иммунорегуляторные медиаторы в ответ на стимуляцию B infantis, мы оценили, могут ли эти ДК индуцировать экспрессию Foxp3 аутологичными Т-клетками in vitro. ДКМП инкубировали с B infantis в течение 4 часов, промывали и повторно инкубировали с аутологичными клетками CD4 в течение 5, 7 или 9 дней. Максимальная индукция Foxp3 по сравнению с нестимулированными ДКМП наблюдалась через 7 дней с или без костимуляции (дополнительный рис. S6A). Во всех последующих экспериментах ДК совместно культивировали в течение 7 дней с аутологичными CD4-T-клетками для оценки индукции Foxp3. После инкубации с B infantis ДКМП, МДК и ПДК индуцировали экспрессию Foxp3 в культурах с CD4-Т-клетками (рис. 8A). Кроме того, усиленная секреция ИЛ-10 наблюдалась в сокультурах ДК-Т-клеток, стимулированных B infantis, по сравнению с Т-клетками, инкубированными с нестимулированными ДК (рис. 8B). Блокирование ТПР-2 значительно уменьшало секрецию ИЛ-10 в сокультурах Т- клеткок ДКМП и МДК, не влияя на секрецию ИЛ-10 в Т-клетках ПДК (рис. 8C), в то время как блокирование ТПР-9 значительно уменьшало секрецию ИЛ-10 в Т-клетках ПДК (рис. 8D). Чтобы определить, какие РСС были ответственны за
предпочтительную индукцию Т-клеток Foxp3, ДКМП предварительно подвергались воздействию анти-ТПР-2 или антимолекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина блокирующими антителами до активации B infantis.
Значительное снижение популяции CD4+CD25+Foxp3+ наблюдалось при блокировке ответов ТПР-2 дендритной клетки. В меньшей степени блокирование молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3- захватывающего неинтегрина также значительно уменьшало индукцию CD4+CD25+Foxp3+ (рис. 9A). Никакой индукции T-bet или GATA-3 положительных Т-клеток по сравнению с исходным уровнем не наблюдалось. Однако инкубация ДКМП с другими бифидобактериями,
которые индуцировали секрецию ИЛ-12p70 из дендритных клеток, привела к индукции T-bet + T-клеток (дополнительный рис. S6B).
Индукция РАЛДГ2 была связана с повышенной способностью ассоциированных со слизистой оболочкой CD103 + дендритных клеток, чтобы индуцировать Т-клетки Foxp3. После ингибирования синтеза ретиноевой кислоты в ДКМП или МДК (с использованием цитрала) или ингибирования передачи рецептора ретиноевой кислоты Т-клеток (с использованием LE135) индукция Т-клеток Foxp3 стимулируемыми B infantis ДКМП и МДК снижалась (рис. 9B). При использовании
ингибитора ИДО 1-метилтриптофана индукция Т-клеток Foxp3 стимулируемыми B infantis ПДК снижалась (рис. 9C). Индукция Т- клеток Foxp3 стимулируемыми B infantis ДКМП также частично восстанавливалась в присутствии 1-метилтриптофана; однако снижение не было статистически значимым и не столь значительным, как это наблюдалось для ПДК-T-клеток (рис. 9D).

Индукция регуляторных Т-клеток Foxp3 является ключевой особенностью иммунной толерантности слизистой оболочки. В этом исследовании мы показываем, что пероральное введение B infantis здоровым добровольцам приводит к увеличению числа Т-клеток Foxp3+CD4+ в периферической крови, что связано с усиленной секрецией ИЛ-10 после стимуляции. Кроме того, наши данные in vitro подтверждают гипотезу о том, что ДК ответственны за индукцию клеток Foxp3. Как МДК, так и ПДК играют определенную роль, но распознают B infantis через различные РСС. Индукция Т-клеток Foxp3 в ДКМП и МДК включает ТПР-2, молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина и метаболизм
ретиноевой кислоты.
Однако индукция Т-клеток Foxp3 в ПДК не зависит от ТПР-2 и ретиноевой кислоты, но требует ИДО. Насколько нам известно, это первый отчет, в котором показано, что подвиды ДК человека используют разные пути при воздействии комменсального микроорганизма, который усиливает экспрессию Foxp3 в аутологичных лимфоцитах CD4.
Т-клетки Foxp3 человека гетерогенны по фенотипу и функционируют, составляя различные, хотя и связанные субпопуляции. Интересно, что усиленная экспрессия ИКОС и ЦТЛА-4 в популяции Foxp3 предполагает, что B infantis индуцирует эффекторный фенотип Treg.31 Введение с пищей B infantis было связано с увеличением числа CD25-клеток, которые экспрессировали Foxp3, но не было никакого эффекта на экспрессию Foxp3 в CD25-популяции. Одно из возможных объяснений заключается в том, что Foxp3 может способствовать экспрессии CD25, поэтому индукция Foxp3 в CD25-клетках, связанная с B infantis, приводит к экспрессии CD25 и их включению в CD25.32 Напротив, B infantis может не индуцировать новый CD25 + Foxp3 + клетки in vivo, а скорее B infantis может стабилизировать и способствовать расширению уже существующей популяции CD25+Foxp3+.
Считается, что состояние микроорганизмов желудочно-кишечного тракта по умолчанию благоприятствует индукции регуляторных лимфоцитов. Например, образование ретиноевой кислоты из витамина А происходит в эпителиальных клетках кишечника и специализированных подвидах ДК, что приводит к превращению нативных Т-клеток в регуляторные Т-клетки Foxp3 T.33 Однако специфичные для кишечника факторы, которые способствуют метаболизму витамина А, плохо описаны. Мы описываем положительную регуляцию фермента, метаболизирующего ретиноевую кислоту РАЛДГ2 в МДК, которые подвергаются воздействию одного комменсального штамма. Реакция ретиноевой кислоты является
функциональной и способствует индукции Т-клеток Foxp3. Таким образом, наличие определенных бактериальных штаммов в желудочно- кишечном тракте может обеспечить необходимые сигналы для связанной с кишечником лимфоидной ткани для индукции ферментов, таких как РАЛДГ2, которые необходимы для поддержания гомеостаза в кишечнике в среде экзогенного антигенного заражения. Удивительно, что метаболизм триптофана, а не метаболизм ретиноевой кислоты
необходим для индукции Foxp3 + CD4 + T-клеток в ПДК при воздействии B infantis. Эти молекулярные механизмы подчеркивают важную связь между рационом питания, составом микробиоты желудочно-кишечного тракта и регуляцией иммунных реакций кишечника. Интересно, что недавние данные других исследователей о короткоцепочечных жирных кислотах, полученных из микробиоты, свидетельствуют о том, что мы, возможно, ранее недооценили важность
взаимосвязи между рационом питания и микробиотой.34 Кроме того, продукция ацетата (после ферментации углеводов) некоторыми штаммами Bifidobacteria опосредует защиту от летального заражения Escherichia coli у мышей.35
Недавние данные о роли РСС-сигнализации в гомеостазе слизистой оболочки подчеркивали тонкое равновесие между различными функциями РСС и показали, что некорректная сигнализация РСС может приводить к воспалению.36 ТПР-2 животные более чувствительны к колиту, индуцированному декстрансульфатом натрия, тогда как варианты гена ТПР-2 связаны с фенотипом болезни у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. Действительно, ТПР-2, как было показано, способствует экспрессии Foxp3 в ответ на воздействие кишечных микроорганизмов в мышиных моделях.37, 38 Наши результаты показывают, что ингибирование активации TПР-2/6 в МДК человека подавляло секрецию ИЛ-10 и индукцию Foxp3, одновременно усиливая секрецию ИЛ-12p70 и ФНОα после воздействия B infantis. Для полной активности РАЛДГ необходима активация молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина с помощью B infantis, а блокировка молекул межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина приводит к формированию значительно меньшего количества Foxp3 + CD4 + T-клеток. Аналогично ТПР-9 необходим для секреции ИЛ-10 в ПДК в ответ на воздействие B infantis. Однако CpG-стимуляция ПДК приводила к усилению экспрессии гена ИФНα, что не наблюдалось при стимуляции B infantis, предполагая, что другие молекулярные пути, отличные от тех, которые индуцируются ПДК в ответ на воздействие данного микроорганизма. Эти данные показывают, что перекрестное действие между ТПР-2/6, молекулами межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина, ТПР-9 и другими РСС определяет врожденный и последующий адаптивный иммунный ответ на воздействие этого комменсального микроорганизма. Соответствующая активация РСС in vivo может способствовать иммунным механизмам гомеостаза, которые ограничивают активацию провоспалительных реакций и защищают ткань слизистой оболочки от повреждений. Кроме того, участие нескольких РСС предполагает, что для оптимальной индукции иммунной регуляторной программы in vivo важны многочисленные бактериальные компоненты, включая липотейхоевые кислоты (ТПР-2), полисахариды (молекулы межклеточной адгезии дендритных клеток 3-захватывающего неинтегрина) и ДНК (ТПР-9). Более того, комменсальный микроорганизм, который способствует выделению всех этих регуляторных факторов, может быть более эффективным при локальной индукции клеток Foxp3, чем комменсальная бактерия, которая способствует выделению только одного или двух регуляторных факторов. Как МДК, так и ПДК присутствуют в желудочно-кишечном тракте в относительно больших количествах по сравнению с их содержанием в периферической крови. У мышей ПДК численно доминируют в собственной пластинке и пейеровых бляшках, в то время как МДК доминируют в брыжеечных лимфатических узлах.39 В мышиных моделях ПДК, как было показано, имеют важное значение для индукции и поддержания толерантности при пероральном введении, поскольку системное истощение ПДК предотвращает развитие толерантности к абсорбированному антигену, в то время как адоптивный перенос пероральных антиген-нагруженных ПДК индуцировал антигенспецифическое подавление CD4- и CD8-Т-клеточных реакций.40 Вероятно, что МДК и ПДК также будут взаимодействовать в отношении индукции толерантности к комменсальным микроорганизмам, отличным от B infantis, но наши данные свидетельствуют о том, что не все бифидобактерии вызывают одинаковый ответ в МДК и ПДК. На некоторых мышиных моделях было показано, что B infantis 35624 препятствует развитию воспалительных заболеваний (включая колит, артрит, респираторную аллергию и инфекционные заболевания). На людях мы теперь демонстрируем in vivo, что пероральное введение этой бактерии приводит к повышенным ответам ИЛ-10 и экспрессии Foxp3 в CD4-T-клетках, и мы описываем потенциальные клеточные механизмы, лежащие в основе этого регуляторного ответа. Работа с числом и функциями регуляторных Т-клеток является захватывающей терапевтической мишенью в широком диапазоне воспалительных заболеваний.41, 42 Более четкое понимание механизмов, используемых in vivo для индукции толерантности при пероральном введении под воздействием микробиоты, вероятно, приведет к рациональным стратегиям для регуляторных и эффекторных Т-клеток, тем самым влияя на желудочно-кишечные расстройства, такие как пищевая аллергия, эозинофильный эзофагит, синдром раздраженного кишечника и воспалительные заболевания кишечника.

Финансирование. Авторы поддерживаются грантами Швейцарского национального фонда (номера проектов 32030-132899 и 310030-127356), Центр исследований и образования в области аллергии Кристин Кюне, Научный фонд Ирландии и компания Алиментари Хэлс Лтд.

Конкурирующие интересы. ДГ и БК являются сотрудниками университетского кампуса компании Алиментари Хэлс Лтд. ЛОМ, ФС и ИК являются консультантами в Алиментари Хэлс Лтд. ФС получал исследовательские гранты от ГСК. ЦА получил исследовательскую поддержку от компаний Новартис и Стэллергенс и являлся консультантом компаний Эктеллион, Авентис и Аллергофарма. ПК, МЗ, РеФ и РуФ не имеют конфликта интересов. Содержание этой статьи не подвергалось ни влиянию, ни ограничению этими фактами.

Утверждение этики. Комитет по этике клинических исследований в Университетских клинических больницах в Корке, Ирландия.

Авторы. ПК, ДГ, МЗ, РФрай, РФерстл и ЛОМ провели лабораторный анализ и внесли свой вклад в интерпретацию данных. ФС, ИК, БК, ЦА и ЛОМ внесли свой вклад в изучение концепции и разработки, анализ и интерпретацию данных и составление рукописи, в то время как ЛОМ контролировал проведение этих исследований.

Источник информации и тщательное рецензирование. Не введены в эксплуатацию; внешнее рецензирование.